连续和分批组合性发酵工艺的制作方法

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/02/0281 发布时间：2021-03-25

专利名称：连续和分批组合性发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及适合饮用的酒精产品，特别是啤酒的生产工艺，具体是采用连续和分批发酵分段加工组成的混合工艺。
背景技术：
酒发酵领域近年发表的大量文献说明了酿酒产业对固定化生产工艺的极大兴趣。在几篇综述(Enari 1995；Iserentant 1995；Masschlein 1997；Mensour等，1997；Stewart 1996；Virkajarvi amp; Linko 1999)中重点叙述了固定化细胞生产啤酒对酿酒业总体状况可能的革命性作用。除了第3.1-3.5节中提到的研究小组外，许多其它机构也参与了用于酿酒的固定化细胞的研发。美国Miller酿造公司(Duncombe等，1996；Tata等，1999)对Meura Delta试验单元以及Schott工程公司提供的流化床生物反应罐进行了一些初步评价。Coors酿造公司也用Meura Delta系统进行了初步实验。
斯洛伐克技术大学与Heineken合作研究了在气升式系统中采用果酸钙凝胶来生产啤酒(Domeny，1996)。前几年，斯洛伐克技术大学的该研究小组发表了几篇关于他们所作研究的文章(Smogrovicova等，1997；Smogrovicova amp; Domeny 1999)。Guinness先前已研究过采用不同的吸附载体进行细胞固定，随后在流化床生物反应罐中发酵(Donnelly 1998)。1999年Donnelly及同事发表了一篇文章描述其流化床生物反应罐中糖代谢的动力学(Donnelly等1999)。他们的实验设置包括采用Siran多孔玻璃珠作为顶部发酵酵母菌的固定载体。Guinness后来成为第2.2.5节中所述Immocon财团的一部分。
德国Holsten Brauerei AG和Lurgi AG共同开发和经营了连续生产无醇啤酒的试验工厂(Dziondziak，1995)。在一步环流床发酵罐(130升)中采用了藻酸钙珠进行发酵，同时用筛网底柱(7层筛网底)脱去啤酒中的乙醇。此工艺共需时间8.5小时。
位于日本的Sapporo酿造公司酿酒研究实验室的一个小组，研究了在流化床反应罐中用固定的细胞生产啤酒的主发酵。他们的研究涉及采用聚乙烯醇凝胶珠(Shindo amp; Kamimur 1990)、藻酸钙凝胶珠(Shindo等1994a)、双层凝胶纤维(Shindo等1994b)和聚氨基葡糖(脱乙酰几丁质)凝胶珠(Shindo等1994)作为固定基质。后一研究中采用了葡萄糖淀粉酶处理的麦芽汁连续进料，其中一升工作容积的生物反应罐中Chitopearl_II型珠(聚氨基葡糖珠)的体积占25％。此酶处理得以在此固定化细胞系统中形成乙酸酯，这类似于常规分批发酵，因此这一步更接近于与产品相配合。
Sapporo研究小组现已将注意力集中于开发用于重复分批方法生产的聚氨基葡糖珠流化床发酵罐。该系统运转了75天没发生大问题，生产的啤酒质量类似于市场产品。非絮凝性酵母菌株显示比絮凝性菌株效率高得多(Maeba等2000；Umemoto等，1998)。
1997年在Maastricht举行的EBC会议上提出了两种其它的双乙酰还原方法。法国学者(Dulieu等，1997)提出采用包囊的乙酰乳酸脱羧酶来快速转化乙酰乳酸成为3-羟基-2-丁酮。Meura Delta重点报道了用硅铝酸盐沸石作为催化剂将乙酰乳酸直接冷转化为3-羟基-2-丁酮(Andries等，1997)的初步结果。如果这些处理方法证明有效并为消费者接受，Cultor和Alfa Laval提出的对此成熟系统的低成本替代方法就可能成为现实。
固定化细胞生产啤酒领域中的其它非产业化研究，包括新加坡“标准和产业化研究所”的线型藻酸凝胶颗粒用于填充床反应罐的研究，发现比藻酸珠更佳(Que1993)。葡萄牙Universidade do Minho的Mafra和及同事报道了采用超絮凝酵母菌株进行啤酒的连续成熟(Mafra等，1997)，该研究小组还发表了关于在气升式生物反应罐中采用他们的絮凝酵母菌生产乙醇的论文(Vicente等，1999；Domingues等2000)。
各学术机构的学者们近年来也研究了用固定化细胞生产啤酒(Argiriou等，1996；Bardi等，1996；Cashin1996；Moll amp; Duteurtre1996；Nedovic等，1996；Nedovic等，1996b；Norton等，1995；Scott等，1995；Wackerbauer等，1996a；Wackerbauer等，1996b)。中国(Chao等，1990；Yuan1987；Zhang等，1988)俄国(Kolpachki等，1980；Sinitsyn等，1986)和捷克和斯洛伐克的研究小组(Chladek等，1989；Curin等，1987；Polednikova等，1981)也研究了固定化细胞技术并于80年代发表了结果。
本发明研究背景依据了许多参考文献，包括如下Abbott，B.J.1978，固定化细胞，见发酵工艺的年度报告，Perlman.D主编，NewYorkAcademic Press，291Anon.1994.Maturex L.Novo Nordisk publication.B560c-GB.
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发明概述本发明涉及适合饮用的酒精产品的生产工艺，包括用于投入和/或至少初步发酵含可发酵糖的麦芽汁和连续发酵阶段。具体说，本发明提供了一种优选工艺，其中使用气升式生物反应，采用絮凝性(特别是高絮凝性或超絮凝性)酵母菌株和严格的氧控制进行连续发酵。本发明一特别优选形式，是将连续发酵的至少部分发酵的排出物输送到分批发酵阶段以完成发酵(在本发明的权利要求书中可包括但不限于发酵过程完全使糖类发酵变成酒精)。
本发明涉及啤酒生产(具体包括淡色啤酒、贮陈(lager)啤酒特别是北美型啤酒)。关于此点参见例如F.Eckhart的“Essentials ofBeer Style”。
根据权利要求1所述的工艺，其中连续发酵阶段在气升式生物反应罐中进行。用于本发明各种实践的连续发酵阶段，优选采用固定化的细胞(与纯粹游离的细胞相反)，这可选用载体固定化酵母菌或絮凝性酵母菌之一进行。尽管如前所述(forging)，优选用絮凝性酵母代替载体固定化细胞，超絮凝酵母菌用于此目的是特别优选的。
关于与连续工艺相关的优选实施方案和优点的更详细说明，提供在本发明详细内容之中，包括采用人工(即受控制的)混合气体，和采用氮气、二氧化碳气、氧气及空气。此外，本文也提供了关于分批体温(hold)阶段工艺的更详细描述。请注意本发明的某些实施方案中，对分批保温工艺的关注超过对可发酵糖类“完全”转变成酒精(总之这事实上可在该工艺的连续发酵阶段完成)。在这类实施方式中，对分批保温阶段的主要关注是口味相匹配(或纠正)，特别是关于双乙酰和乙醛。本发明的优选实施方案提供投入和/或至少部分发酵的麦芽汁连续发酵阶段之后通过分配管道(不论是固定的管道还是可选择性连接和脱开的导管)在多个分批保温贮罐中的分配。在一系列分配过程中装满一罐，再装满下一罐......。在一特别优选的实施方式中，该连续反应罐的物料通过量和分批保温容量就反应罐/分批保温容器的大小和数量而言是相匹配的，这样产品流量与容量/时间比是匹配的。理想的是，分批保温罐排出最终产品的时间刚好在清洗，再连接和连续发酵阶段排出物重装填分批保温罐时。
本发明的另一方面内容是，某些实施方式关于麦芽汁/啤酒中氧含量的具体处理。这种处理应用于此工艺的连续和分批保温两个阶段。连续发酵阶段氧浓度有多种影响。但显著的是使其减到最小并优化而使高级醇转变成口味好的酯可能较为理想。关于此点，注意到如果用所希望的严格控制氧来操纵杂醇酯的口味的平衡，能保持高级醇浓度基本上不受分批保温阶段加工的影响。这点可在连续发酵前用二氧化碳预清洗麦芽汁。
本发明的一实施方式中，该工艺连续发酵阶段的主要目的是提供在其后分批保温加工中发生的下游分批发酵的投料方法。
为了更加肯定，将以上优选权文件的内容全部纳入本文作为本说明书的一部分，如同这些文件在本文中完全复制那样。
发明详述以下是本发明诸方面内容的两部分(发酵工艺)详细说明。
所述说明包括图表、公式、附图等。曲线“图”字后面有一特定编号。每张附图有说明，在“图”字后面有一特定编号。这些绘图中说明的物品可能不是标准单位尺度。
附图如下
图1.试验性规模连续发酵系统工艺的流程图，设备的各个部件见表5.1小结。
图2.50升试验性规模气升式通流管(GLDT)式生物反应罐的模式图。
图3.是图2生物反应罐截面图，包括内部通流管和内部分离器的位置。
图4.是图2生物反应罐顶板详图。
图5.是图2生物反应罐的罐体图。
图6.是图2生物反应罐锥形底详图。
图7.是图2生物反应罐输气管道喷头的详图，在1.27厘米直径的该管道式喷头中共钻了160个孔(直径0.16厘米)，孔中心之间纵向间隔0.8厘米，横向间隔0.6厘米。
图8.采用固定混合器(Labatt专利申请号2.133.789)连续珠法发酵生产的图解说明。
图9.Schott Engineeing提供的Siran_玻璃珠的照片。
图10.World Minerals提供的Celite_硅藻土珠照片。
图11.Labatt酿造有限公司(“Labatt”)实验室生产的κ-角叉菜聚糖凝胶珠照片。
图12.分别代表非絮凝酵母菌、形成链的酵母菌和絮凝酵母菌的照片。这些照片用聚焦显微照相机拍摄，放大100倍。
图13.中等絮凝性酵母菌株LCC3021的显微照片，放大100倍。
图14.超絮凝酵母菌株LCC290的显微照片，放大100倍。
图15.制备κ-角叉菜聚糖凝胶珠固定混合器加工的图解说明。在固定混合器中液体流经该混合器(而不是搅拌器在液体中运动)，使得液体在被泵入管线时混合。
图16.啤酒初发酵用的气升式通流管生物反应罐系统另一模式图。
图17.是图15气升式通流管生物反应罐的照片。
图18.是图16的13升(含8升工作容量)气升式管道反应罐容器的图。
图19.生物反应罐容器顶板详图，其中1、氧传感器的液体吸取口；2、温度传感器的温度计插孔，连接于恒温控制器；3、温度探头；4、氧传感器的液体返回口；5、接种口；6、具有不锈钢盖子的膜采样口。
图20.氧传感器液体吸取口的概貌图，带有浸没在生物反应罐液体中的过滤(filler)元件。
图21.采用气升式生物反应罐系统的连续啤酒初发酵生产的详细装置和前视图(见表5对装置的详述)。
图22.角叉菜聚糖胶凝机制的图解说明(采自Rees，1972)。
图23.初发酵中固定化酵母菌利用麦芽汁成分的图解说明。
图24.含固定化贮陈酵母菌的κ-角叉菜聚糖凝胶珠在零点发酵时的照片。
图25.κ-角叉菜聚糖凝胶珠中贮陈酵母菌分批发酵两天后形成的豆荚状物照片，显示单个酵母菌细胞上的芽痕。
图26.κ-角叉菜聚糖凝胶珠外缘照片，显示连续发酵两个月后的贮陈酵母菌细胞。
图27.连续发酵两个月后κ-角叉菜聚糖凝胶珠外部区域贮陈酵母菌细胞的照片。
图28.连续发酵两个月后κ-角叉菜聚糖凝胶珠中心处贮陈酵母菌细胞的照片。
图29.连续发酵六个月后整个κ-角叉菜聚糖凝胶珠的照片，许多破裂珠呈空心。
发明详述一第一部分酵母菌株和接种物制备本文所进行的发酵采用酿酒酵母系谱的多倍体酵母菌(也称为葡萄汁糖酵母和/或卡尔斯伯糖酵母)。酿造界通常将此酵母菌称为生产贮藏型啤酒的深层发酵菌。这一特征可归因于贮陈酵母菌在发酵完成时能从液体培养基中沉降。而淡色啤酒Ale酵母菌不象贮陈酵母菌，会升到发酵罐的顶部因而称为上面发酵菌株。酵母菌沉底或上浮的能力不一定取决于酵母菌是贮陈型还是ale型，而具菌株特异性。贮陈酵母通常在34℃以上温度不发酵。而ale酵母不能发酵蜜二糖。科学家们将利用这些特征区分贮陈菌株和ale酵母菌(McCabe 1999)。
中等絮凝性酵母菌株是Labatt培养物收藏所(LCC)的酿酒酵母菌株3021，用于游离细胞自聚集发酵和κ-角叉菜聚糖固定化发酵。本试验使用超絮凝性酵母菌作为固定菌株(immobilizant)，纯酵母菌培养物冻存于Labatt技术开发部的-80℃低温冰箱内。当需要时，以无菌接种环取几环的酵母菌培养物在PYG琼脂平板上进行21℃需氧预培养。该琼脂平板用3.5克蛋白胨，3克酵母浸膏，2克KH2PO4、1克MgSO4·7H2O、1.0克(NH4)2SO4、20克葡萄糖、20克琼脂溶于蒸馏水中至1升体积。
然后将分离的酵母菌菌落转移到含10ml巴斯德法灭菌的麦芽汁的试管中，于21℃混合培养24小时。此培养物通过将上一次培养物加入适当体积的麦芽汁中(10ml加入到190ml、200ml加入到800ml、1升加入到4升中)逐步扩增至5升。然后将酵母培养物移入离心罐中，于4C 10000rpm离心10分钟，从所得酵母菌湿沉淀物(30％w/v)中取出所有其后发酵需要的酵母菌团。
发酵培养基采用Labatt伦敦酵造厂生产的工业级贮陈麦芽汁作为所有发酵用的营养培养基。本文的麦芽汁比重，表达为Plato度(°P)，公式4.1说明比重和°P之间的关系。
°P＝135.997·SG3-630.272·SG2+1111.14SG-616.868 (4.1)本发明所用的麦芽汁为17.5°P，相当于比重1.072。
表4.1提供了该麦芽汁典型的糖类组成概貌，是用4.7.2节所述的高效液相色谱(HPLC)法测定的。该麦芽汁中约73％的糖类是可发酵的，而此项研究用的酿酒酵母菌难以摄取27％的长链糖。
表4.1发酵试验所用麦芽汁的典型糖类组成。该麦芽汁由Labatt伦敦酿造厂生产，测得的比重为17.5°P
大多数分析的物质的变异系数在10％～20％之间，这种变异大部分是由于所用的工业生产工艺以及各次酿造所用原料的差异而致。
固定化类型有三种类型——包埋、吸附和自聚集——已在这项博士论文研究中测试过。对于工业来源的载体，由供货商先提供资料，然后通过实验室分析补充。对所研究的载体本文中提供了照片和粒子大小分布资料(当可得到时)。
在预试规模的气升通流管式生物反应罐中测试了两种吸附基质，本文提供了这二种载体的照片。Schott Engineering提供了烧结的多孔玻璃珠载体Siran_。选择直径1～2毫米的颗粒，具有供酵母菌固定化的开放小孔，孔体积占55～60％，孔径分布在60～300□m之间，相当于酵母细胞大小。据报道此种载体生物学和化学上稳定、易清洁、可重复使用，可蒸气灭菌、不压缩、味道中性，因此批准用于食品制造。
加州的World Minerals提供了一种硅藻土组成的球形载体，这种载体优点是热和化学稳定、机械强度高和具刚性。硅藻土是酿造产业常用于过滤啤酒的基础原料。Celite_R-632载体是专门设计用于全细胞固定的。
供货商说明书如下
κ-角叉菜聚糖凝胶珠是由Labatt酿造有限公司实验室生产的一种包埋载体。其生产工艺在5.2节中描述，生产结果见6.2.1节。
最简单的固定化模式为自聚集，可通过选择能絮凝的酵母菌株产生。工业上用的贮陈酵母菌LCC3021天然具有絮凝能力，被认为是一种中等絮凝菌株。随着发酵的进行0.5-1.0毫米酵母小菌丛将在液体培养基中形成。LCC290酵母，是LCC3021贮陈酵母菌的一变异株，将形成大得多的絮凝物(1.0-5.0毫米，取决于混合程度)，因而归类为超絮凝酵母菌，本文提供了各种酵母菌絮凝物的照片。
采样方法随着发酵的进行，必须多次间隔地采取发酵液样品。为了执行这一任务购买了Scandi-brew_的无菌采样阀，这些阀门为不锈钢制品，装有可贮存乙醇保持无菌环境的小室(以顶孔和底孔为界)。取样前除去底部出口管的抵盖，从室中放出乙醇。新鲜乙醇(按体积占75％)流经小室，然后盖上阀门顶孔。拉动阀门杆将大约50ml液体样品收集到无菌容器中，收集的第二份发酵样品含超絮凝酵母菌，因此在细胞计数前要进行适当的脱絮凝。一旦完成采样，阀门小室用热水淋洗，然后用过氧乙酸，最后用乙醇洗。盖上底部出口管抵盖，小室装满乙醇准备好下次采样。
微生物学监测游离酵母细胞计数和亚甲蓝法存活力检查先以上述采样方法收集发酵液含游离悬浮酵母菌细胞的液体样品。采用光学显微镜和10-4ml体积的Hauser科学公司的血细胞计数器进行细胞计数。应用蒸馏水稀释液体样品，达到计数视野中酵母菌总数为150～200个细胞。Heggart等(1999)描述了所有影响酵母菌生存力和活力的因素。为了评估样品中酵母菌的生命力程度，采用美国酿造化学家协会所说的亚甲蓝染色技术(ASBC技术委员会和编辑委员会1992)。活细胞能氧化亚甲蓝使其无色，另一方面死细胞将染成蓝色。制备用于存活力评估的亚甲蓝液采用了以下试剂溶液A0.1克亚甲蓝溶于500毫升蒸馏水中溶液B13.6克KH2PO4溶于500毫升蒸馏水中溶液C2.4克Na2HPO4·12H2O溶于100毫升蒸馏水中将500毫升溶液A，498.75毫升溶液B和1.25毫升溶液C混合制备Fink-Kuhles亚甲蓝缓冲液，最终混合液pH为4.6。在一试管中充分混合稀释的细胞悬液和亚甲蓝。将该混合物静置几分钟(保证细胞和染料接触)，取一滴混合液置于血细胞计数玻片和盖玻片之间(规定体积)。计算计数视野中活的和死的细胞数，然后将活细胞数除以细胞总数，测定活细胞百分比。
4.5.2固定化酵母菌细胞计数——自聚集采用倾向于形成絮凝块的酵母菌细胞时，困难是精确评估液体样品中的细胞百分比，因为细胞在取样瓶中会沉降。为了获得代表性样品，采用了脱絮凝剂。在这些实验中，采用0.5％体积的硫酸溶液破坏絮凝酵母细胞的稳定，从而得到代表性的酵母细胞计数。采用第4.5.1节所述同样的计数和存活力测定程序，以硫酸代替蒸馏水作稀释剂。
固定化酵母细胞计数——凝胶珠在计数凝胶包埋的酵母细胞前，必须用Polytron_装置(Brinkmann Instruments)破坏凝胶基质。先使珠样品通过一灭菌筛网(筛孔大小500□m)，然后用无菌水冲洗。取1毫升凝胶包埋的细胞珠和19毫升蒸馏水，加入50毫升样品容器中，用Polytron_物理性破坏凝胶将酵母菌释放到溶液中。在凝胶已破坏样品上进行5.5.1节所述计数和存活力测定。
污染监测本文所进行的所有发酵过程都定期监测污染情况。监测程序包括每周至少核查一次50升连续发酵罐中的液体和存贮罐中的麦芽汁。无菌采集的液体样品涂布于培养平板(含Universal Beer琼脂(UBA Difco Laboratories)和10mg/L放线菌酮)。将测试样品在厌氧和有氧条件下28℃培养10天。将选出的平板放入含AnaeroGen_包(Oxoid)的罐中，它除去罐内残留的氧气，形成所需的厌氧生长环境。用一指示条(如存在氧会变成粉红色)验证此环境是否确实厌氧。如液体样品中存在污染细菌用此法可检出。
野生或非酿酒酵母的检测需要一种分离培养基，其不利于细菌和/或酿酒酵母菌的生长。将添加了0.4克/升CuSO4的酵母菌培养基(YM.Difco Laboratories)制备倾注平板用于选择性地让潜在的野生酵母菌生长(25℃培养7天)。接种在PYN琼脂(PeptoneYeast-Extract Nutrient.Difco)平板上的液体样品37℃培养7天，进行非贮陈酿酒酵母菌的检查。在34℃以上的温度下贮陈酵母菌生长受到抑制，因此该平板上若有任何生长表明有ale酵母菌污染。
分析方法按标准工业化操作程序对所有有关设备进行适当校准。
乙醇用美国酿造化学家协会技术委员会和编辑委员会所述的气相色谱法(1992)分析啤酒和发酵样品中的乙醇浓度。将脱气的液体样品与5％v/v异丙醇内部标准品混合后取该混合物0.2微升注入Perkin Elmer8500气相色谱(GC)仪中。下表进一步详细提供了GC的确切设置。
火焰离子检测器(FID)Dynatech自动取样品Chromosorb 102，80-100目载体填充氦载气流速20毫升/分钟注射器温度175℃，检测器温度250℃，柱温度185℃等温。
糖类用高效液相色谱(Spectra-Physics SP8100XR HPLC)系统测定葡萄糖、果糖、麦芽汁、麦芽三糖、麦芽四糖、多糖和甘油浓度。阳离子交换柱(Bio-Rad Aminex HPX-87K)用磷酸氢二钾作为流动相，当从该系统洗脱时分离这些糖类。然后用折射率检测器产生适当的化合物峰来确定化合物的量。HPLC操作反压力800psi，柱温度85℃，检测器温度40℃。将样品脱气并稀释至适当水平。取10微升注入该系统、流速0.6毫升/分钟。
酿造业通常用另一方法评估液体的总糖类水平。液体的比重用Anton PaarDMA-58密度仪测定的Plato度表示。将经过滤和脱气的样品移入专门的玻璃U形试管进行电子振荡，测定该液体的振荡频率，然后与液体比重(克/100克或°P)相关连。应注意此种测定是样品糖类总浓度(或比重)的近似值，因为是对20℃的蔗糖水溶液进行校准，其比重与所述麦芽汁相同。
邻位二酮用配备了电子捕获检测器的Perking Elmer 8310气相色谱仪检测双乙酰(2，3-丁二酮)总浓度和2，3-戊二酮总浓度。采用含5％甲烷的氩载气(流速1.0毫升/分钟)作为载气，使样品通过J amp; W DB-Wax柱。注射器温度保持在105℃，同时检测器温度设置为120℃。Hewlett Packard 7694E顶空自动取样器加快了分析。评价所选样品成分的峰面积并将其与2，3-己二酮内部标准品校准值相互参照，计算出含量。为了评估这些化合物的总浓度，先需要将这些样品平衡于65℃并保持30分钟。这种分析前的样品处理得以将乙酰乳酸和羟基丁酸转变成其各自己的二酮、双乙酰和2，3-丁二酮。
酯和高级醇采用顶空气相色谱法测定啤酒中的一些最重要芳香化合物。乙醛、乙酸乙酯、异丁醇、1-丙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯的定量用正醇作为内部标准品。所用的Hewlett Packard 5890气相色谱仪配备有火焰离子化检测器，HP7994顶空自动采样器和J amp; W DB-Wax毛细管柱。注射器温度设为200℃，检测器为220℃。炉温如下40℃5分钟，以10℃/分钟速度从40℃升高至200℃，以50℃/分钟速度从200℃升高至220℃。最后于220℃保持5分钟。以30毫升/分钟(28psig)氦补充气，氢气流50毫升/分钟(25psig)，空气流300毫升/分钟(35psig)补充6.0毫升/分钟的氦载气流。1毫升样品环管的整个GC循环40分钟。
其他分析物在需要的基础上对经历老化和包装的发酵液体进行了其它几种分析物测定，Labatt质控部按各种最终啤酒标准进行了最终产品的分析，这些测定以美国酿造化学家协会技术委员会和编辑委员会所述方法(1992)为基础。表4.2提供了分析一览表以及与这些测定相关的简要说明。
表4.2质量控制分析和说明
酵母菌沉降方法-LCC290制备酵母菌测试样品如4.1节所述在麦芽汁中让超絮凝酵母菌(LCC290)生长。于4℃以10000rpm离心接种物15分钟，获得酵母菌球体用于下一步接种。如4.2节所述，于100℃灭菌麦芽汁60分钟，然后将1升麦芽汁无菌转移至6个2升灭菌摇瓶中，每瓶接种4克经离心的酵母菌。将瓶放入摇床中21℃室温以135rpm使发酵。在以下时间间隔24、40、48、64、71和192小时各取一瓶出来，取液体小样品作糖类分析和酵母菌浓度与存活力测定(具体方法按第4章所述)。其余的液体/酵母混合物按4.7.2节所述酵母菌沉降方法进行。
酵母菌沉降方法采用以下方法测定LCC290超絮凝酵母菌株的絮凝速度。使每份样品发酵直至4.7.1节所述时间。在所述时间取出适当的样品瓶，混合该样品确保所有颗粒悬浮，立即将瓶内容物移入1000ml刻度量筒中，随着絮凝物沉降，每30秒间隔测定液体表面和絮凝物-液体界面之间的距离，沉降速度用以下公式计算。
采用标准的Kynch方法(1952)，从每次发酵间隔时间获得的沉降曲线得出沉降速度对细胞浓度的曲线。
循环和混合速度测定方法为了测定三相气升通流管式生物反应罐中的混合时间和循环速率，采用了与数据获取系统相连接的一酸液注入系统。将强酸液脉冲注入该生物反应罐，可以通过监测pH随时间的变化，然后将其与3.2.2节提出的公式相关连，计算出循环速率和混合时间。该数据获取系统包括与Ingold微处理器pH发送器(2300型)相连的Ingold pH探头(Cole-Parmer，cat#P-05990-90)。
数据翻译DT2805卡386DX计算机和Quick Basic data acqrisition程序(Hudson C和Beltrano J.1994编写，N.Mensour1998修改)。
取10毫升10N盐酸注入气升通流管式生物反应罐(见图5.5)的刚位于pH探头之下的环隙。此处相当于顶板以下26厘米，所有混和实验前用经检定的标准缓冲液(Beckman pH7.0绿缓冲液和pH4.0红缓冲液)对pH探头作二点校准。将pH计产生的4-20毫安电流连接于螺丝接线端板，将电流转化为电压，通过电脑的数据获取卡测定。注入酸液的同时启动数据获取程序，以50Hz的取样频率收集5分钟数据。此程序的数组大小设定为数据获取卡一组获3750点(收集总点数15000点)。
将收集的数据从实验室计算机输送入更强的计算机(奔腾II微处理器)作进一步分析。广泛采用TableCurve 2D(Jandel Scientific Software，Labtrouics，Canada)作数据分析，因其能处理大数据组以及其固有的许多组合数据处理功能(数据过滤平滑，曲线拟合等)。将Savitzky-Golay算法，一种以跨越移动窗口最小二乘方四次多项式拟合为基础的时域过滤平滑方法，应用于原始数据以消除噪声。然后调整经校平的数据而非真实pH测定值反映pH的变化。将衰减正弦函数与经调整的数据拟合，然后从拟合的参数计算出混合时间和循环速率。
在具有三种固定化载体(超絮凝酵母LCC290、中等絮凝酵母LCC3021或κ-角叉菜聚糖凝胶珠)之一的50升气升式生物反应罐内实际发酵时进行这些混合实验。液相是比重2.5°P的发酵啤酒，气相包括二氧化碳喷射气。控制发酵温度在15℃。喷射气表面速度在2.0～6.0毫米/秒之间变动。以某给定气体流速使该系统平衡10分钟。然后开始酸液注入试验，重复三次，选择下一气体流速，将反应罐内的混合物pH值再调整至起始水平。
试验规模气升通流管式生物反应罐系统的设计气升通流管式生物反应罐发酵系统通流管式流体床(DTFB)系统在三相系统中应用已显示其价值。设计了两个相同的试验规模的气升通流管式生物反应罐，安装在Labatt酿造公司的酿酒实验室中以进行本文所述实验工作。此外，改装了几个现存容器供贮存麦芽汁和收集啤酒。图1流程图说明了试验规模连续发酵所用的整个工艺。表5.1列出了图1设备的更详细说明。将伦敦酿酒厂提供的麦芽汁通过5.08厘米不锈钢管道输入1600升工作体积的麦芽汁贮罐(WT1和WT2)中。采用双罐系统可保证试验规模连续发酵罐(R1和R2)营养培养基的不断供应。每个罐配备有二氧化碳喷射系统以控制氧气和均一性，以及一个乙二醇冷却夹套系统控制温度。设置营养培养基中心供应室，通过阀门总管系统(V7、V8和V9)向3个独立的发酵罐进料。Masterflex蠕动泵(P1和P2)用于使所述麦芽汁流入试验规模生物反应罐(R1和R2)中。
表5.1图5.1所示各设备的说明
将二氧化碳气和空气通过不锈钢气体管道喷头喷入该气升式系统(图7)。用转子流量计(RM3、RM4、RM5和RM6)监测注入该系统的流速。气体管道中装有灭菌滤器(0.2□m网孔)以保证不将污染物导入生物反应罐。产物通过溢流系统流出反应罐(图4)。仅用进料泵控制液体滞留时间。二反应罐(R1和R2)连接于废啤酒罐(WBT1)以收集溢流液。采用特定的50升收集罐收集产品和按需要加工。
5.1.1节中提供了50升试验规模生产反应罐的更详细的图解说明和确切尺寸。麦芽汁处理和贮存方法在5.1.2节中提供，连续发酵系统的清洁和灭菌方法见5.1.3节所述。5.1.4节包括本文所述发酵方案。
反应罐设计和说明设计用于此项工作的50升工作体积生物反应罐均用304L不锈钢制造，位于反应罐体部有4个Plexiglas观察窗可观察颗粒和液体运动。所选择的构建材料应能耐受化学消毒剂(腐蚀性和酸性)和耐受蒸气灭菌。设计的另一重要方面是在与发酵培养基直接接触中尽量少用螺纹接头配件，而用焊接。需要时采用可消毒的Tri Clover配件。设计的反应罐将液面上区域扩大，从而最大程度有利于气体分离并促进液-固传质(Chisti和Moo-Yong 1993)。设计的反应罐底部为90度锥形角可最大程度减少固体不收集到底部的情况。图2是安装在Labatt酿酒实验室中的50升试验规模系统的图解说明。此图标明了喷气入口位置，液体入口、乙二醇冷却夹套、产物出口、温度传感和控制系统，以及两个可消毒的取样口的位置。图3是同一GLDT生物反应罐的说明，尺寸为厘米。图4-6为50升气升通流管式生物反应罐的详细分区图，图7是这些实验所用的喷气装置的说明。
图3说明了内部通流管和颗粒分离器(挡板)。根据文献资料(Chisti 1991)选择通流管直径与反应罐直径之比为2/3。颗粒分离器的大小能更好地分离气体与固-液混合物，通过增加该挡板的直径(20.32厘米而通流管直径为10.16厘米)可能获得气泡产生速度和液-固流体下降速度之间更大的差异，将会降低气体夹带进通流管系统的环隙，并导致更佳的固-液传质。
设计一管状喷头(图7)将二氧化碳混合气注入通流管区。在1.27厘米直径的喷头中总共钻了160个孔，孔径0.16厘米，这些孔的中心间纵向间隔0.8厘米，横向间隔0.6厘米(8行每行20个孔)。因为喷气的主要作用是混合，故选择喷气孔直径0.16厘米。
麦芽汁处理和贮存方法传统发酵在不加入酵母菌时，麦芽汁不长时间保存。加氧的麦芽汁是许多微生物(包括酵母菌)的优良的生长培养基。因为连续气升式系统发酵要求大量麦芽汁，必须开发麦芽汁输送和保存方法。按研究人员看法，未加氧的冷麦芽汁如适当输入保存罐中在没有污染时可贮存二周。还认为一旦输入保存罐中必须保证恰当控制麦芽汁的温度。酿造实验室内的罐原先设计用于发酵而非保存麦芽汁。测试了这些罐保持不流动液体温度的性能。图2清楚说明如果要求保持4℃恒温，不混合就不能用这些罐。先在4℃时将麦芽汁装入这些罐，在整个罐的几个点测定罐中的温度以更好了解真实温度。当液体留在罐中24小时不混合时，接近顶层的液温升至大约20℃。罐中部液温也略升(升3度左右)，而罐锥角部分仍接近最初的4℃。
曲线图5.8显示喷气混合对圆锥形麦芽汁保存罐温度分布的影响。在4℃时将麦芽汁装入罐中，装满后24小时测定温度。将CO2气以0.113立方厘米/小时的流速喷入罐中。室温为19.8℃。测温部位(1)罐壁顶部(2)罐中心顶部(3)罐壁中部(4)罐中部中心(5)锥体壁顶部(6)锥体中心顶部(7)锥体底部。
通过注入流速0.133立方厘米/小时的CO2气轻微搅拌，可能将保存罐内麦芽汁温度维持在4℃。由于这些发现在两个麦芽汁保存罐的锥底部装上2.54厘米可消毒管道用于搅拌麦芽汁。
将未通气的麦芽汁从Labatt伦敦工厂通过5.08厘米不锈钢管道转运到缓冲罐中。从此缓冲罐麦芽汁经巴氏瞬间消毒器转运入麦芽汁保存罐之一(WT1或WT2)，在其中贮存于2℃二周。设置了巴氏消毒步骤以小心确保在整个保存期内消除麦芽汁中的不良的微生物。由于采用未通气的麦芽汁，可将氧对热麦芽汁的损害(产生陈旧的醛)尽量减少。此外，用喷气引入空气可严格实现对连续发酵罐的氧控制。
麦芽汁保存在罐内，曾测定麦芽汁中的溶氧。曲线图5.9说明按三种转运方法麦芽汁溶氧浓度随时间的变化。第一个例子，将麦芽汁转移入保存罐并开始喷二氧化碳气(0.085立方米/小时)保证恰当的温度控制。麦芽汁溶氧浓度第一天增高至大约1.3毫克/升，然后下降至第5天为大约0.1毫克/升。第二次试验，装满前用0.85立方米/小时的二氧化碳清洗麦芽汁保存罐共3小时，原先的氧含量显著降低，二天后麦芽汁才达到所预期的氧含量(＜0.1毫克/升)。
图5.9显示从伦敦工厂转运时对麦芽汁中溶氧的控制。第三种方法仅是组合了前二种方法，共评价三种灌装方案。麦芽汁温度保持在4℃。
在最后一试验中，如上所述预先清洗此罐，通过坟过程中连续二氧化碳喷入(0.085立方米/小时)并在储留期内喷气。整个储留期溶氧含量保持最低水平(＜0.1毫克/升)。因此，采纳此法作为所有进一步收集麦芽汁的方案。
5.1.2清洁和灭菌方案使麦芽汁贮存罐经历热水(85℃)预淋洗、腐蚀性清洁淋洗(60℃、40％苛性碱)，然后热水(85℃)后淋洗的清洗阶段，使罐壁接触过氧乙酸液(2％w/v)实现这些贮罐消毒。麦芽汁输送管道也经历同样的清洁和消毒方法。
然后对50升生物反应罐进行不同的清洁和灭菌过程，用60℃热水淋洗该系统，然后装满40℃温水至顶部。在水中加入一种工业清洁剂DiversolCX/A(Diverseylever，Canada)形成2％w/v溶液。以表面气体流速5毫米/秒使空气喷入该反应罐底部以保证适当溶解和在反应罐内适当接触。接触1小时后，排空反应罐，用新鲜的自来水冲洗，此清洁程序反复二次。最后用自来水冷水注满-排空二次。
废啤酒罐用2％w/v Diversol CX/A液清洗，与气升式生物反应罐不同，不用喷气法，因为WBT不配有喷嘴。将该罐侧着滚动进行机械搅拌，重复二次，然后用水注满-排空二次。
蒸气灭菌前，将50升生物反应罐与废啤酒罐相连接，并断开麦芽汁进料管道，气体喷雾管道也断开。打开阀门V10、V11、V12、V13、V14、V15、V16、V17和V18，除去滤器F5、F6和F7，将这些气体管道和滤器分别于121℃高压灭菌15分钟。阀门V12和V16连接蒸气供应。慢慢打开此蒸气阀门尽量减少对设备的损害，密切监视反应罐内部温度。一旦内部温度达到100℃，进行一小时灭菌。先关闭阀门V10、V11、V14、V15和V18，然后关闭蒸气供应并连接已灭菌的滤器F7。立即将已灭菌滤器F5和F6连接于供气管道，开始时二氧化碳气表面流速为3毫米/秒，此气流不仅保证了反应罐在冷却时不会塌陷，而且取代了50升气升式生物反应罐中存在的空气。
在罐内温度达到20℃后，将麦芽汁进料管连通生物反应罐。阀门V2、V5、V10和V14仍关闭，阀门V6、V7、V8、V9、V11和V15打开。V3或V6哪个连通蒸气供气取决于所利用的麦芽汁供应。气流持续1小时，此后关闭阀门V9、V11和V15，同时供应蒸气。一旦管道达到室温(20℃)关闭阀门V3和V6切断蒸气供应。此时整个连续发酵系统包括麦芽汁供应管道，50升生物反应罐和废啤酒罐已灭菌，并准备进行发酵。
5.1.3发酵方案采用50升试验规模气升通流管式生物反应罐，将酿酒麦芽汁连续初发酵为啤酒。乙二醇控温夹套将整个发酵试验中的液体温度控制在15℃。每个反应罐装有一温度探头、一温度热电偶和调节乙二醇进料到反应罐的乙二醇电磁阀门。该气升式发酵罐还备有初步混合气(二氧化碳或氮气)，以及供应氧的空气。通过调节相应的转子流量计/针阀组合，选择需要的混合气体，然后让混合气通过灭菌滤器(Millipore.Millex_-FG50，0.2□m过滤单元)进入生物反应罐的通流管，将表面流速0.39毫米/秒(0.4scfh)的空气注入反应罐进行所有发酵，同时调节初步混合气流速以适合特定的固定化类型。
在连续发酵前，50升气升式生物反应罐开始时按照传统的分批式启动。如5.1.2所述清洁和灭菌后，给该气升式生物反应罐注满50升自麦芽汁保存罐(WT1或WT2)输送来的麦芽汁。然后通过Scandi-Brew_灭菌取样口注入200克酵母菌(4克/升)。就κ-角叉菜聚糖凝胶珠而言，将20升珠注入反应罐，产生每升4克的LCC3021中等絮凝酵母菌的初浓度。每日从生物反应罐采样，并密切监测双乙酰和液体比重的变化。一旦比重达到其最小值，双乙酰浓度跌至30□g/L以下，认为该系统可设置进入连续发酵。发酵培养基(麦芽汁)通过反应罐底部连续进料，同时“生”啤酒通过反应罐顶部漏斗溢出。由于此反应罐工作体积是固定的，选择新鲜麦芽汁进入反应罐的流速，以控制液体平均滞留时间。每日通过灭菌取样阀(Scandi-Brew_)出口从反应罐取液样，用于化学和微生物学分析(第4章所述方法)。
在选择的时间内，从50升初发酵生物反应罐收集到大量连续发酵产品(40升灭菌不锈钢罐)进行发酵后加工，以产生最终的可销售啤酒，进行评价和与工业化生产的对照啤酒作比较。断开所选50升生物反应罐与废啤酒罐的连接，立即与啤酒收集罐连接。一旦收集到所需液体再将生物反应罐与废啤酒罐连接，将收集的“生”啤酒进行发酵后保温，以将其双乙酰水平降到30□g/L以下。使液体留下的酵母菌沉降，并使液体(每毫升含1～5百万个细胞)冷贮藏在2℃7天而老化。老化期后过滤液体、稀释至酒精占体积5％，充二氧化碳气，灌装341ml啤酒瓶。所有灌装的酒液用Labatt工厂设备作巴氏消毒灭菌。
5.2连续凝胶珠生产工艺此节实验工作的目标是评价连续珠法生产工艺，为了向5.1所述的50升连续气升通流管式生物反应罐提供固定化LCC3021酵母菌细胞而生产接种了酵母菌的凝胶珠。
此生产工艺(图8)首先要求用固定混合器在非水连续相(植物油)和水分散相(与酵母菌细胞混合的κ-角叉菜聚糖凝胶溶液)之间形成乳液。下一步是快速冷却以诱导聚合物胶凝，将形成的凝胶珠加入到氯化钾液中促进其变硬并使凝胶珠与油相分离。
在控制温度37℃的水浴中进行κ-角叉菜聚糖凝胶珠乳液的形成，以防止角叉菜聚糖胶成熟前发生胶凝。将灭菌的聚合物维持在37℃水浴中。固定化前将酵母菌接种物维持在20℃。用Masterflex蠕动泵(Cole Parmer公司，USA)将凝胶和酵母菌浆通过6.4毫米直径固定混合器的24个构件泵入以将细胞均匀分散在凝胶内。将室温储存的无菌油泵(Masterflex蠕动泵)入热水浴也达到37℃。
然后通过另一组固定混合器使接种了酵母菌的聚合物(水相)与油(连续相)混合产生所需的乳液。将产生的乳液在冰水浴中迅速冷却至5℃，使聚合物液滴胶凝成珠。再将珠放入无菌的22克/升氯化钾溶液中，帮助其变硬并与油相分离。用过的油再循环返回加工并将水相(珠和氯化钾溶液)移入分离罐进行大小分类，然后装入50升生物反应罐中。
5.2.1固定混合器-Kenics型此新颖的珠法生产工艺的心脏是Kenic固定混合器(Cole Parmer InstrumentCompany，Niles，Illinois，USA)，它们由位于管道内内径相当于固定混合器直径的一组固定构件组成。这些构件形成了交叉通道，使通过固定混合器的液流分流和纵向重组。这些精细产生的流线受该混合系统所迫横向断裂而成为均一性提高的乳液。表5.2列出了用于此项研究的三种类型固定混合器。
表5.2 Kenics固定混合器说明(Cole Parmer提供)
5.2.2生产凝胶珠的材料生产凝胶珠的两种基本材料是油和聚合物。κ-角叉菜聚糖(型号X-0909，批号330360 Copenhagen Pectin，Denmark)是一种提取自红藻的多糖聚合物，为CopenhagenPectin A/S赠送。此聚合物具有热胶凝特性，胶凝温度取决于κ-角叉菜聚糖([Car])和氯化钾(KCl)二者的浓度。将该聚合物溶于80℃含2克/升KCl的蒸馏水中，浓度30克/升。产生的凝胶溶液胶凝温度为28℃。121℃高压灭菌此凝胶1小时，然后置于40℃水浴中不会变硬。商品级玉米油(Pasquale Bros.Inc.Canada)也于121℃灭菌1小时，存放室温(20℃)直至使用，如4.1所述准备好酵母菌浆。
5.2.3凝胶珠直径测量在含100毫升的22克/升KCl溶液的烧瓶中于5℃热交换器出口处收集珠样品，将珠浸泡在该溶液中2小时使之变硬，通过用KCl液连续洗涤从水相中分离出油。分析前样品保存在4℃防止微生物污染。珠直径测定采用成象分析软件Optimas(4.02版，BioScan公司，美国)连接有录象机(PentaxMacro 50mm)，将珠样品移入含有薄的水膜(用来分离凝胶珠)的平皿中，置于摄像孔下。用此系统共测定300-400颗珠。Optimas软件的容量在100□m至几毫米之间，最高绝对误差30□m。进一步用Microsoft Excel分析Optimas获得的数据。通过样品平均直径(DB)和变异系数(COV)，特征分析所得的样品大小分布。
5.2.4凝胶珠系统评价-实验计划比较了共3种固定混合器直径(DS＝6.4mm，9.5mm和12.7mm)，以评估那种类型的珠可按照样品的平均珠径和大小分布变异系数测定的那样生产。固定混合器构件数(Ns)在12-120之间变化，而测定的聚合物体积分数(□c)在凝胶/油溶液体积比8.3％～50％之间。□c高于50％时，分散相(凝胶)和连续相(油)倒转，即油滴包含在聚合物基质中，而非凝胶滴包在油基质中。将油/凝胶乳液通过乳液区的表面液体流速调节至3.6cm/秒和17.8cm/秒之间，用以下公式计算通过乳液固定混合器的表面液体速度(VS)VSL=Q油+Q角)/S其中S是装有固定混合器的管子的横截面积，Q油是油相的体积流速，Q角是角叉菜聚糖胶液的体积流速。
结果和讨论50升气升式生物反应罐的发酵和混合动力学采用固定化细胞生产乙醇的研究已经发表。过去20年内学者们尝试将固定化细胞技术与连续加工结合起来优化乙醇生产工艺(Kuu，1982；Gil，1991；Maiorella，1983)，许多人取得成功，采用连续固定化细胞系统生产乙醇已产业化。然而，酿造业要实施这种连续工艺进行初发酵生产啤酒，不那么简单。啤酒不仅含乙醇，还含无数芳香化合物、增加了最终产品的复杂性和深度，以下章节描述作者在试验规模GLDT发酵罐中生产良好平衡的啤酒所获得的结果。
6.1试验规模GLDT系统的分批发酵分批发酵采用自由悬浮酵母细胞，在50升试验规模气升通流管式生物反应罐中进行。这些试验提供了机会来评估采用此系统发酵麦芽汁生产啤酒的可行性。此外，此试验为进一步与连续发酵液相比较建立了一基准尺度。在50升生物反应罐中用Labatt Cultrue Collection的贮陈酵母菌株(LCC3021)进行了二批发酵。监测了发酵全过程中酵母菌生长速度，以及营养消耗和产物释放。
图6.1和6.2分别提供了分批发酵1和2的酵母菌浓度和存活力变化图。这两种情况酵母菌生长的典型速度文献中都有报道。亚甲蓝测定的活力始终是高的，存活力值保持在90％左右。批次1和2的糖类浓度见曲线图6.3和6.4。酵母菌先摄取单糖葡萄糖和果糖，然后消耗麦芽糖和麦芽三糖，整个发酵过程中麦芽四糖和更大的多糖水平维持不变。乙醇是酵母菌代谢最重要副产物之一。优化的需氧发酵每代谢100克葡萄糖将产生约48克乙醇和47克二氧化碳。也产生小量甘油(每100克葡萄糖产生3.3克)，因为此副产物可维持发酵酵母菌的氧化还原平衡，以及支持细胞的渗透压平衡，特别是在高渗培养基中。曲线图6.5和6.6说明了发酵时乙醇和甘油浓度的变化，发酵开始时乙醇浓度升高很慢，因为当酵母细胞处于其有氧生长期时，发酵培养基中存在氧。一旦耗尽氧，乙醇水平呈指数级升高直到可代谢糖耗尽，此后其浓度水平下降。邻位二酮也是酵母菌代谢的非常重要的副产物。曲线图6.7和6.8提供了批次1和2的总双乙酰和戊二酮浓度。这些化合物升高至大约40小时，相应于酵母浓度的峰值，是酵母生长期进行氨基酸合成所致。发酵后期酵母菌将双乙酰、戊二酮及它们的前体α-乙酰乳酸和α-酮丁酸转变成相应的香味较低的活性二醇。从本节提供的结果知道两批发酵在气升通流管式生物反应罐中进行正常。酵母增殖和糖类摄取遵循预期途径，副产物乙醇、双乙酰和戊二酮也一样。各批资料的比较表明两批发酵方式很相似。曲线图6.9比较了批次1和2的乙醇浓度，曲线在许多数据点按相同的形式彼此重叠，表明水平重复。虽然气升系统中底物消耗和随后产生产物的顺序没有变化，但发酵速度有变化。两批均在大约80-85小时乙醇浓度达到峰值，代表初发酵完成。再过20小时双乙酰降低到30μg/L以下。这些结果提示高比重麦芽汁初发酵可在约100小时内完成，相比较，传统的贮陈分批发酵要120-168小时。气升通流管式生物反应罐提供的混合对减少发酵时间有贡献，因为提高了此系统的传质。利用这些资料有把握地进行了进一步的发酵试验，相信气升通流管生物反应罐不会显著改变酵母菌的发酵代谢。该系统用游离悬浮的酵母菌发酵能减少分批发酵时间至少20小时。
曲线图6.1试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵1的细胞总浓度和存活力随发酵时间的变化
曲线图6.2试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵2的细胞总浓度和存活力随发酵时间的变化
曲线图6.3试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵1的碳水化合物浓度随发酵时间的变化 曲线图6.4试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵2的碳水化合物浓度随发酵时间的变化
曲线图6.5试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵1的乙醇和甘油浓度随发酵时间的变化 曲线图6.6试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵2的乙醇和油浓度随发酵时间的变化
曲线图6.7试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵1的双二酰和戊二酮浓度随发酵时间的变化 曲线图6.8试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌分批发酵2的双二酰和戊二酮浓度随发酵时间的变化
曲线图6.9试验规模GLDT生物反应罐中LCC3021酵母菌第1批和第2批的乙醇浓度随发酵时间变化的比较。
6.2固定化载体此研究项目研究了几种载体为下一步开发工作鉴定出最有应用前景的载体，在50升气升通流管式生物反应罐中测试了三种不同形式的固定化。评价了两种大小在1～2mm之间的市售的吸附载体。Siran_是Schott Engineering提供的一种玻璃珠载体(图9)，Celite_是World Minerals提供的一种硅藻土珠(图10)。因为它们易处理且可购得而进行了试验。吸附载体提供了更易无菌操作的机会，因为反应罐可先装上载体，再原位灭菌，最后在反应罐中直接接种酵母菌。从产业化立场这种选择非常吸引人，因为此种载体不需要专门贮存，工厂不必明显改变其接种方法。
用这两种载体在50升气升通流管式生物反应罐中初步发酵的结果不好。出现的问题主要是Siran_和Celite_颗粒的密度与液体培养基相比太高。当载体和液体密度比保持接近1时，此三相气升通流管系统工作良好。就Siran_而言此比例为1.34，而Celite_比例为1.31。固液相之间有这样高的密度差异的结果是明显升高了操作50升气升通流管式生物反应罐所要求的最低气体流化速率。对于4升Siran_载体(8％v/v固体负荷)需要21.5毫米/秒(根据排气管直径)的气体流速以实现循环。在水溶液中试验时这种较高气体流速不是重要问题，然而一旦液体培养基为麦芽汁时，气升通流管(LGDT)系统中会发生毁灭性的失败。这种气体流速会引起反应罐中过度发泡，最后使液体水平面降至通流管以下，实际上停止了液体和固体循环。类似的失败在用Siran_代替Celite_作为固定化材料时也可遇到。由于这些结果，在下一步气升发酵试验中放弃使用这些吸附性载体。
采用类似κ-角叉菜聚糖的包埋性载体使此系统可用固体负荷40％(v/v)并在其流化和随后的循环中需要每小时0.17标准立方米气体(5.8毫米/秒的表面气体速度)流速。用角叉菜聚糖包埋的酵母菌细胞珠操作此系统，得到了好结果，是因为此载体密度较低(约1110公斤/立方米)和流化容易。类似地，自聚集性酵母菌LCC3021(中等絮凝性)和LCC290(超絮凝性)所需的固体负荷，可用保证能够适当循环所要求的大约3毫米/秒的气体流化速率而达到，6.2.1更详细地说明了κ-角叉菜聚糖凝胶载体。6.2.2描述了自聚集酵母菌-LCC3021和LCC290絮凝物，评价了它们用作50升GLDT发酵罐连续初发酵固定化基质的效果。
6.2.1κ-角叉菜聚糖凝胶珠包埋固定化方法要求将酵母菌细胞包在基质中，然后移入发酵罐中。因为此时反应罐原位接种不可行，必须在开始发酵前生产这些凝胶珠。尚不清楚长期贮存对接种的凝胶珠有什么影响。为了尽量减少任何可能的不良贮存作用，决定在短时间(8小时)内生产大量凝胶珠。固定混合器的珠工艺见5.2节所述并用于此目的。理想的珠应具有0.8-1.4毫米的颗粒直径(DB)，粒径分布的变异系数保持最小。必须调整珠制备加工的几个参数生产所需数量和均一的珠。以下章节小结了珠工艺的参数选择，6.2.1.2描述了连续发酵试验用的珠。
6.2.1.1珠生产工艺变量选择与其他学者合作进行了珠制造工艺的特征，强调以下工艺参数，固定混合器的直径(Ds)，固定混合器构件数目(Ns)、表面液体流速(VSL)和聚合物体积分数(□c)。曲线图6.12-6.21小结了实验获得的结果。曲线图6.12说明用固定混合器工艺在角叉菜聚糖凝胶中固定化酵母菌获得的典型颗粒大小分布。此例中采用以下参数固定混合器直径12.7毫米，60个固定混合器构件，表面液体流速10.5厘米/秒，聚合物体积分数0.25。测定的平均珠径为701□m，变异系数45％。曲线图6.13显示累积粒径分布，看来与用样品均值和标准差计算的正态累积分布相符合。用de KolmorogofSmirnov方法(Scheaffer et Mc Clave，1990)检验了正态性，计算出实验数据和拟合数据之间的最大距离(K-S统计量D)为0.0274。相应于正态分布的数据修正的D值其95％可信限水平，必须低于0.895。我们的实验计算出修正的D值是0.174，在0.895限值以下，可作出结论我们的数据与正态分布相符。从这次珠制造加工收集的所有数据显示的粒径分布只有一个峰。然而Poncelet等(1992)显示出现几个附属峰和/或一个次级峰，相应于在搅拌罐中分散产生的直径小于200□m的藻酸珠。可能我们的工艺中产生的较小珠在珠洗涤步骤中丢失，因而不出现在我们的粒径分布数据中。
曲线图6.14和6.15分别说明了表面液体流速和固定混合器直径对平均珠径和粒径分布的变异系数的影响。对所有三种固定混合器平均珠径随表面液体流速增加而减小，12.7毫米固定混合器影响最明显。用较小直径的固定混合器(6.4和9.5毫米)在所有测试的液体流速时均不产生平均直径大于700□m的珠，而12.7毫米直径固定混合器在液体流速低于11厘米/秒时即产生大于700□m的珠。所有三种直径固定混合器产生的珠变异系数为38％～58％，也显示这三种情况下流速增加时变异系数减少。变异系数随固定混合器直径而变，用最小直径的固定混合器产生最低数值。
在3.5厘米/秒表面流速时，聚合物体积分数看来会影响平均珠径，而流速7厘米/秒以上时□c实验值在0.083～0.5之间变化，相对不产生差异(曲线图6.16)。看来提高表面液体流速时，聚合物体积分数不影响或很少影响变异系数(曲线图6.17)。曲线图6.18和6.19说明表面液体流速和固定混合器构件数对平均珠径的影响。随着液体流速增加，所有不同数目固定混合器构件产生的平均珠径均降低(曲线图6.18)。在给定液体流速下24-120个构件产生的平均珠径相似，而12个构件产生的珠径大于其它5种测试的结构。图6.19也显示24个以上固定混合器构件的平均珠径达到最小。
曲线图6.20说明表面液体流速对不同数目的固定混合器构件产生的变异系数的影响。看来液体流速不影响所有测试的结构的变异系数。固定混合器构件数目对变异系数的影响更显著(图6.21)，固定混合器构件增加使变异系数减少，60个构件时达到最小值45％，这些结果在3.6-17.8厘米/秒之间的表面液体流速范围内是一致的。
已提出如下假设，固定混合器直径(Ds)增加可在搅拌器中产生不均匀的剪切力，如变异系数的测定表明会导致粒径分散度增加。同时Ds增加将降低剪切力的强度，从而提高平均珠径。这两种作用见于采用最小直径固定混合器生产凝胶珠时，最小平均珠径为400～500□m，最小的粒径分布变异系数约40％。
生成乳液所需能量与聚合物和油相界面面积成比例。珠越小，形成珠的能耗越大。Berkman和Calabrese(1988)证明平均表面流速(Vs)增加会使每单位质量的液体的耗能增加，故有利于珠径减小。平均表面液体流速(在3.6-17.8厘米/秒之间测定)增加使平均珠径减小。流速增加导致固定混合器入口和出口之间的压力差，这种压力差与每单位质量液体耗能成比例。流速增加因而导致系统耗能增加，有利于减少珠径。当表面液体流速增加时观察到(产生的)珠径(DB)减少。Al Taweel和Walker(1983)证明相当于显著湍流水平的高流速时，珠的形成和珠间聚集建立起动态平衡。对于恒定的固定混合器直径(Ds)和构件数目(Ns)，表面流速对变异系数几乎没有作用。因此流速是一可操纵和选择平均珠径，但不显著改变粒径分布的参数。
在本研究范围内，角叉菜聚糖凝胶体积分数(□c)对平均珠径或变异系数没什么影响，除了在研究的最低速度3.6厘米/秒时平均珠径随□c的降低而降低。Audet和Lacroix(1989)研究过在双相分散系统(分批搅拌罐而不是连续固定混合器工艺)产生角叉菜聚糖凝胶珠的此参数，他们的结论是□c不影响角叉菜聚糖浓度3％(w/v)的聚合物溶液的平均珠径。Audet和Lacroix(1989)研究了κ-角叉菜聚糖凝胶浓度对珠径分布的特殊影响，显示此参数强烈影响珠径分布。凝胶浓度增加导致平均珠径(DB)和变异系数(COV)增加。此种影响归因于高浓度时凝胶粘度提高导致对乳液剪切力降低而形成较大的珠。虽然本文没研究凝胶浓度对珠径的影响，但若需要可用作控制珠径的另一手段。
混合器构件数(Ns)增加，固定混合器内液体的平均滞留时间增加，导致更均匀的混合和形成更小的分布更密集的珠。在一实验中，约60-72个构件达到了分布平衡(用变异系数测定)。Middleman(1974)证明对低粘度(0.6～1.0cP)乳液10个构件足以获得这种平衡。本实验用的角叉菜聚糖溶液(3％w/v)平均粘度为200cP，油的粘度为25cP。因此这种较高的粘性需要液体在混合器中停留较长时间以达到大致均一。
曲线图6.12用固定混合器加工产生的凝胶珠的典型珠径分布，此例中的加工参数为Ds＝12.7mm，NS＝60，VSL＝10.5cm/s，□c＝0.25。
曲线图6.13用固定混合器加工产生的凝胶珠的典型累积珠径分布，此例中的加工参数为Ds＝12.7mm，NS＝60，VSL＝10.5cm/s，□c＝0.25。
曲线图6.14表面液体流速(厘米/秒)对平均珠径(□m)的曲线图。评价了三种不同的固定混合器直径(Dsl2.7mm，9.5mm和6.4mm)，固定混合器构件数(Ns)保持恒定，为48，聚合物分数□c设定为0.25。
曲线图6.15表面液体流速(厘米/秒)对珠径变异系数(％)的曲线图。评价了三种不同的固定混合器直径(Dsl2.7mm，9.5mm和6.4mm)，固定混合器构件数(Ns)保持恒定，为48，聚合物分数□c设定为0.25。
曲线图6.16表面液体流速(厘米/秒)对平均珠径(□m)的曲线图。评价了4种聚合物分数(□c0.5，0.25，0.125和0.083)。固定混合器构件数(Ns)保持恒定，为48，固定混合器直径(Ds)设定为12.7毫米。
曲线图6.17表面液体流速(厘米/秒)对珠径变异系数(％)的曲线图。评价了4种聚合物分数(□c0.5，0.25，0.125和0.083)。固定混合器构件数(Ns)保持恒定，为48，固定混合器直径(Ds)设定为12.7毫米。
曲线图6.18表面液体流速(厘米/秒)对平均珠径(□m)的曲线图。固定混合器构件数(Ns)变化为12，24，48，60，72和120。聚合物分数(□c)保持恒定，为0.25，固定混合器直径(Ds)为12.7毫米。
曲线图6.19表面液体流速(厘米/秒)对珠(□m)变异系数的曲线图。固定混合器构件数(Ns)变化为12，24，48，60，72和120。聚合物分数(□c)保持恒定，为0.25，固定混合器直径(Ds)为12.7毫米。
曲线图6.20平均珠径(□m)对固定混合器构件数(Ns)的图。表面液体流速(厘米/秒)变化为3.6，7.0，10.6，13.2和17.8。聚合物分数(□c)保持恒定，为0.25，固定混合器直径(Ds)为12.7毫米。
曲线图6.21珠径变异系数(％)对固定混合器构件数(Ns)的图。表面液体流速(厘米/秒)变化为3.6，7.0，10.6，13.2和17.8。聚合物分数(□c)保持恒定，为0.25，固定混合器直径(Ds)为12.7毫米。
6.2.1.2珠生产工艺κ-角叉菜聚糖特性从上节所述资料，有可能选出生产具有所需特征的珠的凝胶珠生产工艺参数供发酵试验用。为尽量减少某特定固定混合器直径的变异系数，选择了60个混合构件来产生油-凝胶分散体。选出直径平均约1毫米的珠以尽量减少外部传质和用机械方法促进珠与发酵液的分离。为实现此目的选择了所测试的最大固定混合器(12.7毫米)和最低速度(3.6厘米/秒)。由于聚合物分数对变异系数几乎没有作用，故采用了凝胶油为50/50比率(□c＝0.5)以达到最大的珠生产率。
在本实验室用5.2节所述工艺Ds＝12.7mm，NS＝60，VSL＝3.9cm/s，和□c＝0.5生产了几批包埋了LCC3021酵母菌的凝胶珠。使产生的珠(图11)通过一系列筛网去除大于2.0毫米和小于0.5毫米的珠。图6.23提供了产生的珠的颗粒大小分布。图6.24说明这些珠的累积粒径分布。这是整个50升气升式发酵试验中所用的典型分布。
曲线图6.23 50升气升通流管式生物反应罐连续发酵试验所用的κ-角叉菜聚糖凝胶珠的珠粒大小分布。
曲线图6.24 50升气升通流管式生物反应罐连续发酵试验所用的κ-角叉菜聚糖凝胶珠的累积珠粒大小分布。
6.2.1.3工业规模用珠生产工艺的限制开发并在试验性工厂水平实行每台固定混合器每小时生产10升珠的工艺。可能认为在产业规模生产珠之前此工艺在几个方面还要进一步开发和/或优化。必须增加该系统的容积生产率以提供大规模生物反应罐进料所需要的大量固定化细胞。例如2000hL气升通流管式生物反应罐需要大约800hL珠。为达到这样的容积必须增加凝胶和油的流速。资料提示用直径6.4-12.7毫米的固定混合器产生的流速增加，可形成小到此发酵系统不能用的珠。因此必须增加固定混合器的直径，从而提高平均珠径。然而采用直径较大的固定混合器也会增加珠粒大小的分散度，产生较大百分比的大小超过所需范围的珠。另一种方法是采用平行放置的中等大小(12.7毫米)的固定混合器系统，用10个固定混合器系统相信生产率可达到100升/小时。对于2000hL的产业化生产，此工艺连续实施了800小时或约34天以生产出所需体积的珠。可开动几套系统以减少生产时间但这又产生了另外的复杂性。如能长时间贮存珠同时保持酵母菌存活力，生产时间可能就不是什么问题了。据信可以开发出干燥珠或将珠贮存在真空密封容器中的方法。Poncelet及同事(1993)发表的文章提出必须考虑所用的此型固定混合器可产生离差，他们建议的系统采用另一类型固定混合器，与本研究所用的Kenics型相反，可采用较大直径的搅拌器而不会损害珠粒大小分布(保持最小的变异系数)。
对目前试验性工艺的另一担心，包括在40℃操作此系统并采用植物油和氯化钾溶液来生产珠。由于较高的生产温度，在工艺中要求有加热及冷却系统。因而要求对酵母菌细胞须暴露的潜在热冲击作进一步研究，对潜在的负面影响作评估。本研究中所生产的固定化细胞珠中酵母菌存活力很高(90％以上)，但此工艺是否可能对酵母菌群引起其它作用没有研究。因为用油来产生所需的乳液，进而形成珠，由于油起表面活性剂的作用会抑制泡沫形成，珠表面残留油是一个问题。虽然在发酵阶段油的残留有帮助，但带入最后的啤酒中则是有害的，因为发泡是最终产品所需要的。用大量氯化钾液来分离固相珠与油，也需要研究将珠装入生物反应罐前从珠浆中去除盐液的方法，否则在珠加入反应罐后还必须从反应罐中冲洗除去此溶液。
由于在生物反应罐外生产固定化细胞的珠，必须在珠制备加工全过程中采用无菌技术并保持无菌直到将珠加入生物反应罐。各罐之间的各转运点提供了污染机会，必须监测，因为存在的污染菌可能一起被固定在珠中。本实验室努力的结果是可生产出均一的无菌珠。然而工厂环境不适合于实验室，因而要求更严格地控制。
6.2.2絮凝性酵母菌细胞最常见的天然固定化形式之一是微生物自身聚集成细胞絮状物。Calleja和Johnson提出细胞互相接触形成聚集体有三种可能原因，具有不同的结合特性。第一涉及不同性别细胞释放信息素(□和A因子)互相吸引，此种结合是暂时性的，涉及固定在互补性细胞壁中的□和A凝集素之间的蛋白质-蛋白质结合。细胞在出芽过程中也可能因不能与其母体细胞分开而聚集，这可能是特殊酵母菌株固有的或可能是营养缺失或一些基因突变所致。这种现象称为链形成而非絮凝，这些细胞间的结合可因机械剪切力而不可逆地破坏(Stratford，1996)。第三种更常见的称为絮凝。Stewart和Russell(1981)定义絮凝为“一种可逆的现象，酵母菌细胞粘连成菌丛，在它们悬浮的培养基中会快速沉降或上升至培养基表面。”广泛的证据表明絮凝是受遗传控制的，絮凝的机制依赖于所选的分子起着毗邻细胞壁之间桥梁的作用。更具体说，据认为特异性凝集素在钙离子存在时，结合于毗邻细胞的甘露聚糖(Calleja和Johnson，1977)。已发现这种蛋白质/糖结合受到螯合剂或特异性糖的可逆性抑制。
图12描述了三种可能的酵母菌细胞结构，称为非絮凝酵母菌、链形成酵母菌和絮凝酵母菌。链形成酵母菌虽然细胞聚集，但不认为它是一种絮凝，因为细胞起初就不是单个的。絮凝意味着单个细胞由于环境有利(钙离子和低水平抑制性糖)聚在一起形成团。就絮凝细胞而言，絮凝物的特定大小可能取决于细胞的遗传本能以及细胞所接触的流体动力学环境(剪切环境)。图13和14着重说明了具有不同絮凝程度的两种Labatt贮陈酵母菌株，图13为中等絮凝性酵母菌株LCC3021。在存在钙离子时此菌株在液体培养基中的葡萄糖一旦耗尽时就形成0.5～1.0毫米的聚集体。图14是超絮凝酵母菌株LCC290的照片，形成的絮凝物大于1毫米，在低剪切力环境下聚集成直径5毫米的团。在温和搅拌情况下，LCC290絮凝物直径在1～2毫米之间。已提出了评估酵母絮凝性的几种测定方法(Speer和Ritcey，1995；Akiyama-Jibiki等，1997；Teixera等，1991，Stewart和Russell2000)。在“Brewer’s Yeast”(Stewart和Russell，2000)中提出酵母菌絮凝测定方法可分为三类沉降法，静态发酵法和直接观察生长培养基中的絮凝物形成。
1937年Burns首先描述了沉降法，1953年Helm和同事进行了改进，成为美国酿造化学家协会技术委员会和编辑委员会所承认的目前标准分析方法的一部分(1992)。此技术称为体外技术，因为酵母菌的沉降特征是用硫酸钙缓冲液而不是用真正的发酵培养基评估的。静态发酵法(也称为Gilliland法)涉及在希望的麦芽汁中培养酵母菌并在体内测定其絮凝特征。这两种方法都要测定沉降的酵母菌样品和已脱絮凝的酵母菌样品的吸光度，采用紫外/可见光分光度计。Stewart和Russell(2000)提出一种酵母菌絮凝测定方法目视观察20毫升螺纹盖玻璃瓶中生长的酵母菌样品所发生的絮凝水平。为了说明絮凝程度，他们采用主观评分法，例如5极强絮凝，4强絮凝，3中等絮凝，2弱絮凝，1-略微和0-无絮凝。超絮凝酵母菌株LCC290归类为4-强絮凝，而LCC3021菌株归类为3中等絮凝。
絮凝在酿造业中是一种重要特征，因为酵母菌天然倾向于沉降或浮在表面，通常可用作此酵母菌与发酵液分离的方法。然而，在发酵前已完成絮凝的酵母菌株是不理想的，因为培养液还没有产生理想量的酒精并有糖残留。在连续发酵，具体讲在气升通流管式连续发酵中絮凝酵母菌起着固定化基质作用。其沉降倾向可通过注入喷气补偿，使其保持悬浮。采用这种系统可消除未能充分发酵液体培养基的担心，因为固体颗粒不断地循环与发酵液保持密切接触。
6.2.2.1节中检定了超絮凝酵母菌LCC290的沉降性能和发酵性能。令人感兴趣的是鉴定到这种特殊酵母菌株发生的絮凝。此外，测定了该酵母菌的沉降速度，提供了能用于将来酵母沉降罐设计的有价值信息。
6.2.2.1超絮凝酵母菌LCC290的检定用超絮凝酵母菌LCC290在气升通流管式生物反应罐中进行连续发酵前，决定以实验室规模摇瓶发酵来检定该酵母菌。曲线图6.28显示酵母菌群随时间的变化。如预期那样，前48小时菌浓度急剧上升，然后停止增加，发酵结束时水平略降。前48小时麦芽汁中有足够的养料和氧供酵母菌生长，然而随着酵母菌不断消耗糖类并缺氧，其将不能增殖而是进入厌氧发酵期。一旦糖类供应耗竭，小部分酵母菌开始死亡。此现象见于曲线图6.29，图中细胞存活力从大约97％降到略高于90％。
曲线图6.30显示发酵期间糖类的消耗。酵母菌先消耗单糖葡萄糖和果糖。然后相继摄取麦芽糖和麦芽三糖。然而酿酒酵母不能代谢麦芽四糖或更长链多糖(poly 1和2)。随着总糖浓度降低(见曲线图6.31比重曲线所示)乙醇浓度成比例上升，发酵大约37小时时，乙醇和糖类浓度相等。从生长和糖类代谢看，似乎超絮凝酵母菌LCC290的表现像工业酵母菌株LCC3021。当液体比重达到约2.7°P时，发酵看来达到结束。常见发酵结束前絮凝酵母菌株形成大块(絮凝物)并从溶液沉降出来。这种现象在酿造业称为“hung”发酵。在我们的分批试验中，我们能结束发酵，因为可摇动瓶子使酵母菌悬浮与营养供应密切接触。所研究的另一重要特征是此酵母菌絮凝的能力。具体讲，我们感兴趣的是确定该酵母菌沉降的速度，以及得到一种指示该特殊酵母菌株何时开始絮凝，这两种特征对连续发酵试验都重要，因为它们在维持气升发酵罐中的健康酵母菌群中发挥作用。曲线图6.32显示发酵过程中酵母沉降曲线。测试24小时的发酵样品几乎不出现沉降，絮凝受到存在的某些糖的抑制，葡萄糖是一种已知的抑制剂，因此一旦此抑制剂被耗尽絮凝才开始。分批发酵40小时的样品中当采用4.7节所述方法测试时细胞开始絮凝并从溶液沉降。所有测试的时间沉降都非常快，除了24小时不发生沉降。在进行的最慢的40小时沉降试验中，此酵母菌花了90秒钟从试验装置中完全沉降。71小时时沉降需要不到50秒。
学者们提出沉降速度是固体浓度的函数(Coe和Clevenger，1916)。曲线图6.33表示某给定酵母细胞浓度时固体的沉降速度。采用Kynch提出的方法(1952)，根据各发酵时间间隔收集的沉降数据产生了该曲线的数据点。这些结果获得大致相同的曲线，证实了Coe和Clevenger(1916)观察到的相同现象。
此沉降试验收集的结果表明，超絮凝酵母菌株LCC290在液体比重6°P和更低时将絮凝。此数值可用作连续发酵的一个指南，表明如果需要保持细胞絮凝，应保持此拟稳态液体比重。操作时反应罐高于6°P将有絮凝细胞失去稳定的风险，可能导致固定化酵母菌群被洗掉。超絮凝酵母菌的沉降特征表明，如果静置不流动此酵母菌群将迅速沉降。在用三相气升通流管式生物反应罐时，可能使这些细胞保持在循环中，然而在没有气体供应系统的情况下，该细胞群将迅速沉降，可能要采用辅助性喷气来重悬浮固体。对于发酵后加工，此种快速沉降特征有益，可采用固体分离装置如重力沉降器来大量去除固体。在酿造产业，这将减轻离心设备的固体负荷，因而得以在离心桶报废之前使用更长时间。预计啤酒损失会较少离心，使啤酒香味丢失(虽然极小)也会减到最少，因为通过离心机的酵母生物量水平较低。
曲线图6.28搅拌分批发酵的LCC290酵母菌细胞总浓度对发酵时间的图，发酵温度保持在15℃。
曲线图6.29亚甲蓝测定的酵母细菌存活力对发酵时间的图。
曲线图6.30LCC290酵母菌分批发酵的糖类浓度对发酵时间的图。
曲线图6.31LCC290酵母菌分批发酵的乙醇和甘油浓度及液体比重对发酵时间的图。
曲线图6.32酵母菌悬液的界面高度对沉降时间的图。该图的数值收集于几个发酵时间间隔。
曲线图6.33酵母菌悬液的沉降速度对细胞浓度的图。该图的数值收集于几个发酵时间间隔。
6.3啤酒连续发酵的气升技术评价本文第一和最重要的目的是评价采用κ-角叉菜聚糖凝胶珠包埋卡尔斯伯糖酵母细胞(见6.2.1节所述)以连续方式操作50升试验规模气升式生物反应罐的可行性。此外，我们需要调查用此系统是否能生产具有人们乐于接受的香味的北美型贮陈啤酒。我们也想确定此连续发酵系统中高比重麦芽汁(17.5°P)完全发酵所需的最少滞留时间，和建立氧的操作范围。
所有麦芽汁中的糖都耗尽的最少滞留时间是24小时。与其相比，经典的分批发酵时间为5-7天，尽管在喷气中加入氧(0-20％v/v)，生物反应罐中的原位Ingold氧探头测得的溶氧浓度仍接近零。这表明麦芽汁中的氧已被酵母细胞快速消耗或简单地在废气中排出。啤酒溢流液中的游离细胞水平为每毫升生啤酒108个细胞。邻位二酮、双乙酰和2，3-戊二酮的水平及乙醛水平随喷气中的氧比例下降而下降(曲线图6.34和6.35)。测得的酯(乙酸乙酯和乙酸异戊酯)和高级醇(丙醇、异丁醇、异戊醇)似乎不受供氧变化的影响(图6.36)曲线图6.37比较了用连续固定化细胞系统生产的两批完成试验的啤酒与对照工业化生产(游离细胞分批发酵)的啤酒中各种芳香活性化合物。连续发酵啤酒和对照之间不论供氧水平，都观察到酯(乙酸乙酯和乙酸异戊酯)和高级醇(丙酮)的某些差异。用2％氧生产的啤酒的口味通过一组受过训练的品酒师判断相当接近对照啤酒(工业化生产)，然而用20％氧生产的啤酒判断为具有香味氧化的迹象和“纸板味”和“酒”味而不可接受。
在似稳态时6周内，试验规模生物反应罐运作的滞留时间为24小时，注意到“生”啤酒具有可接受的口味而表明没有重大缺陷(硫磺气)。此试验时喷气中提供的氧量是关键因素，用含氧2～5％的喷气生产的啤酒获得了最佳口味。这个关键性的控制点需要将注意力进一步集中于对一系列发酵前后分析物的更精确的氧测定技术。
传统的分批初发酵中，麦芽汁是在输送入发酵罐前加入氧。接种培养基后由于被酵母细胞消耗，溶氧浓度迅速下降(发酵初24小时酵母菌增殖)。发酵的其余时间是在几乎厌氧条件下进行的。采用连续均一系统初发酵不会发生这种氧浓度随时间而变化。因此，用连续和分批发酵生产的啤酒可能很难获得完全的口味相一致。尽管有这些差异，此初步评估中测试的生物反应罐结构生产出了具有可接受口味和分析曲线图的啤酒。通过采用气升式生物反应罐和较小的珠(约1毫米尺寸)，能够提高生物反应罐的容积生产率并减少初发酵好几天时间。释放入所得啤酒中的生物量水平显示，固定化细胞生物反应罐中酵母菌生长水平相当于在相似条件下游离细胞分批发酵的水平。这些观察证实芳香物的形成依赖于酵母菌生长水平。这可解释以前试图用限制生长的固定化细胞系统未能生产出可接受啤酒的原因。提供受控制的混合气体可能是在连续固定化细胞发酵中精细调节啤酒口感性能的一种强有力方法。其它学者也观察到所得啤酒中有高水平的双乙酰(Virkajarvi amp; Pohjala，1999；Kronlof等，2000)。北美贮陈型啤酒的双乙酰目标水平为30□g/L，与之相比排出的此连续发酵液的水平为400-800□g/L。采用传统的老化技术(2℃冷老化14天)可将双乙酰降低至所需水平，但损害了整个工艺的生产率。采用第2章报告的快速次级发酵技术有助于降低双乙酰而不明显降低生产率(2小时加工)。然而增加成本可能是人们不愿意的，所有酿造者可能不想让其啤酒经历高温(80-90℃)。
曲线图6.34邻位二酮浓度和喷气中的氧百分比的关系。在装有40％(v/v)角叉菜聚糖凝胶珠的50升气升式系统中进行发酵。总的喷气速度保持恒定，为6.4scfh，滞留时间24小时。
曲线图6.35乙醛浓度和喷气中氧百分比的关系。在装有40％(v/v)角叉菜聚糖凝胶珠的50升气升式系统中进行发酵。总的喷气速度保持恒定，为6.4scfh，滞留时间24小时。
曲线图6.36酯和杂醇浓度和喷气中的氧百分比的关系。在装有40％(v/v)角叉菜聚糖凝胶珠的50升气升式系统中进行发酵。总的喷气速度保持恒定，为6.4scfh，滞留时间24小时。
图6.37用含2％氧和20％氧的喷气生产的最终产品啤酒和工业产品啤酒及风味阈值的比较。连续发酵生产，是在装有40％(v/v)角叉菜聚糖凝胶珠的50升气升式系统中进行发酵。总的喷气速度保持恒定，为6.4scfh，滞留时间24小时。
6.4三相气升通流管式生物反应罐发酵的混合和循环速率采用4.8节所述酸液注入法进行混合实验。此期实验的目的有二。我们首先要在不同的表面流化气体速度下，用多种固化化载体通过计算液体循环速度和得出的混合时间评估该气升系统是否能很好混合。这些试验与文献报道的试验区别在于全部实验在真实的发酵培养基上用活酵母细胞进行而不是在模型溶液(水-固-气系统)上进行。这些混合实验也适合计算表面液体流速，可用于进一步放大该试验系统。
6.4.1探头的校准采用4.8节所述方法校准混合试验中用的pH探头。将pH探头发出的4-20毫安信号通过250欧姆电阻转变为1-5伏信号，其可为数据采售卡(DAC)所记录。将pH探头依次浸泡在以下一系列缓冲液pH4.6、pH4.0、pH5.0、pH6.0最后pH7.0的缓冲液(Beckman检定标准品，Cole Parmer)中。曲线图6.38为该采集系统收集Ingold pH探头对5种标准pH溶液反应的数据。曲线图6.39是pH探头校准曲线，用真实pH值与测定的信号电压绘制。该系统的最佳拟合校准曲线(相关系数为0.9996)由以下公式确定pH＝3.68×电压-3.53 (6.1)用公式6.1将收集的混合数据换算以反映气升生物反应罐中测得的真实pH值。
还测定了pH探头对pH变化的反应时间。图6.40-6.43表明pH探头对4步不同pH变化即0.6、1.2、2.3和3.4变化步骤的典型反应。采用Table Curve 2D(JandelScientific)数据绘图和分析软件，将原始数据拟合为一脉冲函数，所得拟合曲线的相关系数大于0.994。从这些曲线计算出该探头对该变化步骤的98％的反应时间，然后对pH变化步骤绘图(曲线图6.44)。在所测定的范围内反应时间随pH变化步骤而减少。对最小的pH0.6变化步骤，pH探头反应时间约为6.4秒。pH改变3.4时响应时间减少至大约4.2秒。
探头的此特性很重要，特别当该系统用于评价混合时间和循环速率时。对于测定反映培养基pH变化的探头应具有低反应时间。具体说如果要准确用于这种测定，pH探头反应时间必须低于反应罐中的循环速率。然而不需要拟瞬间反应性，因为反应的稍微滞后将简单地反映在连续循环速率测定值中，因而可抵消。
曲线图6.38数据采集系统对Ingold pH探头对各缓冲溶液的反应所获得的原始数据与时间的关系。采集频率是50Hz总共15000个点。
曲线图6.39pH探头校准曲线表明，pH和测定的电压(V)的关系。最佳拟合曲或校准曲线具有以下公式pH＝3.68×电压-3.53，相关系数0.9996(N＝2500)
曲线图6.40pH探头对pH一步改变约0.6的响应时间的典型数据。用Table Curve软件拟合反应。该最佳拟合脉冲函数的相关系数为0.995。
曲线图6.41pH探头对pH一步改变约1.2的响应时间的典型数据。用Table Curve软件拟合反应。该最佳拟合脉冲函数的相关系数为0.999。
曲线图6.42pH探头对pH一步改变约2.3的响应时间的典型数据。用Table Curve软件拟合反应。该最佳拟合脉冲函数的相关系数为0.999。
曲线图6.43pH探头对pH一步改变约3.4的响应时间的典型数据。用Table Curve软件拟合反应。该最佳拟合脉冲函数的相关系数为0.999。
曲线图6.44Ingold pH探头对一步改变的响应时间(N＝3)。将浸在较高pH缓冲液中的探头立即浸在低4.0的较低pH缓冲液中。用每一反应曲线的最佳拟合线计算出该探头达到该步变化98％所需的时间。
6.4.2混合时间和循环速度混合时间和循环速度实验对三种类型固定化细胞发酵进行。在50升试验规模通流管式生物反应罐中以不含固体的模型水溶液，然后在含κ-角叉菜聚糖凝胶珠、超絮凝LCC290酵母菌或中等絮凝LCC3021酵母菌、比重2.7°P的发酵培养液中进行此实验。曲线图6.45和6.46是在脉冲注入酸液(4.8节所述方法)后用此pH探测系统收集的原始数据的采样说明。曲线图6.45说明pH探头对酸液注入不含固体的水溶液中的反应，而曲线图6.46是对酸液注入含高絮凝性酵母菌LCC290的发酵培养液的反应。将信号与衰减的正弦曲线相拟合。用相应公式计算出相关系数，分别为0.96和0.90。图中拟合参数“b”和“c”对应于衰减正弦公式(3.1)中所述的“a”和“□”值。在公式3.2和3.3中利用这些数值计算出该系统的循环速度和ijwg时间。附录B包括有其余的ijwg数据和所有实验的曲线拟合。
曲线图6.47和6.48是酸液注入不含固体的水溶液中时混合时间和循环速度图，曲线图6.49和6.50是用高絮凝酵母菌LCC290进行混合实验的相应图示说明，曲线图6.51和6.52提供了κ-角叉菜聚糖混合试验的结果。最后，曲线图6.53和6.54显示了中等絮凝酵母菌LCC3021的混合时间和循环时间。不论测试的固体类型，随着表面气体流速的相应增加，混合时间和循环速度减少。对于所有四种测试系统，循环速度和表面液体流速之间的关系遵循Kennard和Janekah(1991)提出的公式3.11。
水/无固体系统和κ-角叉菜聚糖凝胶珠系统混合时间遵循公式3.11。采用絮凝酵母菌作为固定化基质的这二种系统没显示出与Kennard和Janekah理论模型的强相关性。LCC290和LCC3021系统的初始混合时间(直到表面气体流速超过4毫米/秒)低于该模型预测值。然而混合时间减少的速度当表面气体流速高于4毫米/秒时减慢，而该模型的值较低。表6.1提供了得出的循环时间和混合时间相对于表面气体流速的计算公式。
曲线图6.55说明所有4种系统混合时间和表面气体流速的关系。水/无固体系统显示一pH脉冲值混合98％所需时间最高(Vsg 3毫米/秒时约220秒)，而LCC290系统能在该系统中使一次酸的脉冲的作用减到最小(Vsg 3毫米/秒时约110秒)。LCC3021和κ-角叉菜聚糖系统的数值在水/无固体系统和LCC290系统之间。通过激发产生涡流和促进共轴混合，气升生物反应罐中的固体有助于液相流动成分的分散。超絮凝酵母菌LCC290虽然固体负荷(16％w/v)与中等絮凝酵母菌LCC3021相同，但在所有测试的表面气体流速时，其混合时间较快。曲线图6.56说明所有4种测试系统的循环时间和表面气体流速的关系。表面气体流速为2毫米/秒时，循环时间在28～35秒之间，用水/无固体系统有最快的循环速度，而LCC290系统显示最慢的循环速度。在较高气体流速时，4种系统之间的差异降至大约3秒。然而对于所有测试的流速，LCC290系统显示略慢的循环速度，而水/无固体系统循环速度最快。
曲线图6.57说明表面气体流速和表面液体流速之间的关系。用Livingston和Zhang(1993)提出的公式3.7计算给定循环速度和固体类型时的表面液体流速。随着表面气体流速的相应增加表面液体流速增加。LCC3021和水/无固体系统有类似超势，而LCC290和κ-角叉菜聚糖系统显示某种类似性。Kennard和Jenekah提出的模拟公式适合于表面液体流速对表面气体流速的曲线(图6.57)。图6.58为用公式3.10计算实验得出的表面液体流速对理论上计算出的表面液体流速的图。所有4种系统均符合斜率为1和起点为y＝0的线性函数关系所示的公式。表6.1列出了此项研究工作所测试的系统得出的相关性。
曲线图6.45 50升气升通流管式生物反应罐中pH探头的反应数据。将酸液脉冲式注入不含固体的水溶液中。表面气体流速设为1.94毫米/秒。原始数据与衰减性正弦曲线相吻合。相关系数为0.96。
曲线图6.46 50升气升通流管式生物反应罐中pH探头的反应数据。将酸液脉冲性注入含有高絮凝酵母菌LCC290的发酵培养基中。表面气所体流速设为1.94毫米/秒。原始数据与衰减性正弦曲线相吻合。相关系数为0.90。
曲线图6.47 50升气升通流管式生物反应罐中混合时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入不含固体的水溶液中。混合时间等于使pH该步改变取消98％所需时间。(N＝3) 曲线图6.48 50升气升通流管式生物反应罐中循环时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入不含固体的水溶液中。(N＝3)
曲线图6.49 50升气升通流管式生物反应罐中混合时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有高絮凝酵母菌LCC290(絮凝物大小＞1.0毫米)的发酵培养基中。混合时间等于使pH该步改变取消98％无效所需时间。(N＝3)。
曲线图6.50 50升气升通流管式生物反应罐中循环时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有高絮凝酵母菌LCC290(絮凝物大小＞1.0毫米)的发酵培养基中。(N＝3)
曲线图6.51 50升气升通流管式生物反应罐中混合时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有用κ-角叉菜聚糖凝胶珠(珠径1-2毫米)固定的酵母菌(LCC3021)的发酵培养基中。混合时间等于使pH分步改变取消98％所需时间。(N＝3) 曲线图6.52 50升气升通流管式生物反应罐中循环时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有用κ-角叉菜聚糖凝胶珠(珠径1-2毫米)固定的酵母菌(LCC3021)的发酵培养基中。
曲线图6.53 50升气升通流管式生物反应罐中混合时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含中等絮凝酵母菌LCC3021(絮凝物大小＜0.5毫米)的发酵培养基中。混合时间等于使pH这步改变取消98％所需时间。(N＝3) 曲线图6.54 50升气升通流管式生物反应罐中循环时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含中等絮凝酵母菌LCC3021(絮凝物大小＜0.5毫米)的发酵培养基中。(N＝3)
曲线图6.55 50升气升通流管式生物反应罐中混合时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有不同固体的发酵培养基中。混合时间等于使pH这步改变取消98％所需时间(N＝3)。
曲线图6.56 50升气升通流管式生物反应罐中循环时间和表面气体流速的关系。将酸液脉冲性注入含有不同固体的发酵培养基中。(N＝3)。
曲线图6.57 4种测试系统-LCC3021酵母菌、LCC290酵母菌、角叉菜聚糖凝胶珠和水/无固体系统的表面液体流速(毫米/秒)和表面气体流速(毫米/秒)的关系。在50升试验规模气升通流管式生物反应罐中进行此试验。
曲线图6.58 4种测试系统的理论表面液体流速(毫米/秒)和试验测定的表面液体流速(毫米/秒)。用Kennard和Janekah(1991)提出的以下关系公式计算理论值VSLαVSGM，直线斜率为1，Y轴截距为0。
表6.1 4种测试系统计算的混合时间、循环速度和表面液体流速的相关性小结
对于表面液体相关性，Kennard和Janekah(1991)提出蒸馏水中指数为0.41，当该溶液含有羧甲基纤维素和乙醇时，为0.64。LCC290和LCC3021系统此指数分别为0.419和0.427，而κ-角叉菜聚糖系统和水/无固体系统指数为0.283。
对气升通流管式技术的基本假设是该系统可传递足够的搅拌力，使反应罐中的液体成分完全混合。50升试验规模系统连续发酵时，新鲜营养培养基从反应罐底以36毫升/分钟流速注入至总体积50升。这代表着进料成分大约1000倍稀释。计算LCC290酵母系统的混合特征，反应罐中约3次循环即混匀了液体成分，而水/无固体系统需要10次循环。此外，滞留时间(24小时)比混合时间(180秒)大约高1000倍。该系统中快速混合与营养物稀释相结合，混合时间与滞留时间相差很大强烈提示其是一种充分混合的系统。采用气升生物反应罐的最初前提是提供啤酒发酵的一种理想的混合环境。对所有三种发酵载体上进行的混合研究结果支持此前提。
6.5评价在气升系统中连续的发酵用的几种固定化方法使用三种固定化载体-κ-角叉菜聚糖凝胶珠、超絮凝LCC290酵母菌和中等絮凝LCC3021酵母菌在50升试验规模气升通流管式生物反应罐中进行连续发酵。所有发酵最初投入相同水平的酵母菌接种物(4克/升)，工业产的贮陈麦芽汁用作营养培养基，发酵以批方式开始得以快速还原麦芽汁糖类以及促进发酵罐中的酵母菌增殖。用絮凝酵母菌时这种分批方式得以形成酵母菌絮凝物，一旦开始连续进料其可保持在发酵罐内。当发酵液中的双乙酰水平下降到30微克/升以下，麦芽汁开始不断进料。以下章节更详细描述对这三种固定化基质得到的发酵物的分析。
6.5.1κ-角叉菜凝聚糖凝胶珠包埋采用κ-角叉菜聚糖凝胶珠作为固定化基质有助于对气升技术连续初发酵啤酒(6.3节)进行评估。仍然需要评估这一系统是否可长时间(2月以上)运作而无重大的操作困难，包括发酵不稳定和污染。曲线图6.59显示此发酵试验的操作参数，二氧化碳表面气体流速设为5.5毫米/秒，而导入发酵罐的喷气中的空气为0.9毫米/秒，总喷气中的氧合率为3％，与6.3节中的结果恰巧一致，表明当该系统导入2-5％的氧时产生优良的啤酒。发酵温度控制在15℃，数据中可见某些波动，它们涉及所用控制环路的性能。
曲线图6.60说明游离酵母菌细胞群随时间的发展和酵母菌的存活力。在2个月发酵期间存活力维持相当高，伴有约200小时时短暂性降低。这对应于开始连续进料麦芽汁之前的时刻。分批发酵中常见发酵结束时在存活力下降，因为细胞失去了养料。一旦开始连续性麦芽汁进料存活力返升至90％以上。在发酵初400小时，游离细胞酵母菌群是低的，而在此后的300小时中，它增加约10倍，从1亿细胞/毫升升到15亿细胞/毫升。一旦到达此最大浓度，游离细胞酵母群在剩余的发酵时间中维持此种拟稳态值。游离酵母浓度的突然增加可能联系到固定化酵母细胞群。发酵开始时，包埋在凝胶中的酵母将在凝胶内部生长，直到可利用的空间均已被占据。一旦凝胶珠被酵母充满，扩充的菌群将进入液体培养基。我们的结果似乎说明，在最初400小时，固定化的酵母在凝胶内生长，在700小时左右，酵母在珠内已没有更多地方可以生长，因此开始释放大量细胞到培养基中。酵母菌群的不稳定反映在乙醇和比重曲线(曲线图6.61)中。发酵最初的200小时，预计乙醇随时间上升，比重则遵循传统的分批动力学而下降。200～600小时之间乙醇升至45克/升平台，比重维持于6°P左右。此结果不是所期望的，因为发酵末了液体的比重约为2.5～2.7°P。约600小时左右游离酵母菌群达到其最大值时，乙醇水平升至大约70克/升，麦芽汁比重降至2.2°P左右。更密切观察糖类随时间变化的特征性曲线(图6.62)，表明麦芽糖浓度不稳定直到大约600小时。其它糖类如预期地那样降低。
监测了2个月连续发酵过程中另外二个重要分析物-双乙酰和2，3-戊二酮(曲线图6.63)。大约180小时时的低点相应于分批的起始期结束，一旦开始连续进料，双乙酰和2，3-戊二酮分别迅速升高至500□g/L和400□g/L。这种最初的升高是预期中的，因为新鲜营养供应刺激了酵母菌增殖，从而提高了排出的代谢物水平，产生双乙酰和2，3-戊二酮。整个发酵期间2，3-戊二酮水平维持在400□g/L以上而双乙酰浓度从500□g/L下降至连续发酵中期的275□g/L。这点也与6.3节报告的可行性评估中所观察到的双乙酰水平下跌到2，3-戊二酮水平之下相吻合。
图6.59角叉菜聚糖固定化发酵的操作参数与发酵时间的关系 图6.60角叉菜聚糖固定化酵母菌的总酵母菌浓度和存活力与发酵时间的关系
图6.61角叉菜聚糖固定化酵母菌连续发酵的乙醇浓度和比重与发酵时间的关系 图6.62角叉菜聚糖固定化酵母菌连续发酵的糖类变化情况和发酵时间的关系
图6.63角叉菜固定的酵母菌连续发酵的邻位二酮浓度和发酵时间6.5.2超絮凝酵母菌株的应用自身絮凝用装有LCC290超絮凝酵母菌的50升试验规模气升式生物反应罐进行连续发酵3个月。CO2喷气设为约2.5毫米/秒而以约0.4毫米/秒导入空气以促进某些酵母菌生长(这相当于导入1.51升/分钟总气体中含3％氧)。反应罐的发酵温度整个运转期保持在15℃左右。一次供电中断，迫使我们将发酵罐温度降至4℃3天(发酵大约1700小时时)(曲线图6.64)。发酵罐冷却是为了在断电期减慢酵母菌代谢维持其存活力。这一意外事件提供了一个机会来评价该系统从工业情况下可能常见的事件中恢复的能力。一旦恢复供电反应罐温度重新调至15℃再发酵30天。
一旦完成了分批起始期(约180小时)，以2.16升/小时流速向该系统连续供给麦芽汁，从而在反应罐工作容量50升的基础上提供了24小时滞留时间。分批起始期后，细胞浓度上升，发酵约750小时时达到30亿细胞/毫升(曲线图6.65)，然后在1000小时左右酵母细胞群降低至10亿细胞/毫升左右并维持此水平直到发酵结束。酵母菌存活力在整个发酵期为90％以上(图6.65)。
连续进料开始后很快乙醇浓度和发酵液比重达拟稳态(曲线图6.66)。发酵其余时间乙醇浓度上升至70克/升左右，液体比重为2.3°P左右。曲线图6.67的糖类变化曲线证实连续发酵270小时左右进入拟稳态。发酵1400小时左右多糖浓度约从42克/升降至约33克/升，此结果是因为麦芽汁各批间的差异。因为贮陈酵母菌不能消耗这些多糖，这种麦芽汁营养的异常对初发酵罐的性能无显著影响。这种不发酵糖成分的差异可由经训练的品酒师成员检测，他们会告知此产品具有“淡爽”酒体。
曲线图6.68提供了双乙酰和2，3-戊二酮浓度随时间的变化，如用κ-角叉菜聚糖连续发酵那样，一旦开始连续进料麦芽汁，双乙酰和2，3-戊二酮水平便升高。双乙酰达到约375□g/L，而2，3-戊二酮浓度为约600□g/L。整个发酵期维持此浓度水平直到1700小时左右断电，由于发酵液分批地静置3天没有进一步的酵母菌代谢(因缺乏营养)，邻位二酮水平下降。一旦再开始进料麦芽汁，双乙酰和2，3-戊二酮恢复其拟稳态值。
曲线图6.64LCC290发酵的操作参数和发酵时间的关系。
曲线图6.65LCC290酵母菌的总酵母细胞浓度和存活力与发酵时间的关系。
曲线图6.66LCC290酵母菌连续发酵的乙醇浓度和比重与发酵时间的关系。
曲线图6.67LCC290酵母菌连续发酵的糖类浓度与发酵时间的关系。
图6.68LCC290酵母菌连续发酵的邻位二酮浓度与发酵时间。
6.5.3中等絮凝酵母菌的应用自身絮凝在50升试验规模气升式生物反应罐中采用作为固定化基质的中等絮凝酵母菌株LCC3021进行了几次发酵。如前述的两种固定化模式那样，最初的酵母菌浓度设定为4克/升。将此酵母菌投入工业生产的贮陈麦芽汁(见4.2节所述)中，进行分批发酵直到所有可发酵糖类耗尽和双乙酰水平降至30□g/L以下。发酵温度控制在15℃，喷气速度控制在与LCC290发酵相同水平(表面CO2气流速～2.5毫米/秒，空气～0.4毫米/秒，总喷气中氧占大约3％)(图6.69)。
这种先分批发酵使得酵母菌细胞发生絮凝并易于在气升系统中维持絮凝。分批起始期末，麦芽汁进料速度设为2.16升/小时，相当于在50升反应罐工作容量中滞留时间约24小时。在整个1000小时(连续发酵开始的500-1500小时)内酵母菌群(曲线图6.70)增加至约10亿细胞/毫升并维持此水平。发酵1500小时左右酵母菌群突然倍增，水平稳定于20亿细胞/毫升，酵母菌群的这种变化是出乎预料的，发酵期酵母菌活力保持90％左右(曲线图6.70)。
曲线图6.71提供了3个月连续发酵中乙醇浓度和发酵液的比重。分批起始后不久(约180小时)乙醇浓度稳定于70克/升，比重达到最低值约2.2°P。上述酵母菌群的突然增加并不反映在乙醇浓度的降低。这种酵母菌群增加的最符合逻辑的解释是，酵母菌群的大部分进入了增殖期而产生酵母浓度的倍增。已预期到乙醇浓度的降低会与酵母菌浓度增加相符，但这显然不是因为乙醇在整个连续发酵过程中维持在其拟稳态值70克/升上。糖类浓度变化和发酵时间的曲线(曲线图6.72)揭示与乙醇和比重曲线相同的结论。此次发酵在连续发酵约250小时时达到其拟稳态。
曲线图6.73提供双乙酰和2，3-戊二酮浓度曲线和连续发酵时间的关系。像κ-角叉菜聚糖凝胶和LCC290邻位二酮的结果一样，在分批起始期后双乙酰和2，3-戊二酮浓度升高分别达到拟稳态值225和400□g/L。
图6.69LCC3021发酵的操作参数与发酵时间的关系 图6.70LCC3021酵母菌的总细胞浓度和存活力与发酵时间的关系。
图6.71LCC3021酵母菌连续发酵的乙醇浓度和比重与发酵时间的关系。
图6.72LCC3021酵母菌连续发酵的糖类变化与发酵时间的关系。
图6.73LCC3021酵母菌连续发酵的邻位二酮浓度与发酵时间的关系。
6.5.4各种载体的比较6.5.1～6.5.3诸节中提供了作为固定化基质的κ-角叉菜聚糖凝胶珠、LCC290超絮凝酵母菌和LCC3021中等絮凝酵母菌的发酵性能。认为所有三种载体都适合在50升试验规模气升通流管式生物反应罐中连续初发酵。所有三种情况都实现了液体滞留24小时。采用LCC290超絮凝酵母发酵达到拟稳态比LCC3021中等絮凝酵母菌和κ-角叉菜聚糖固定化酵母系统快得多。LCC290发酵在进行到250小时左右达到其最高乙醇浓度70克/升。LCC3021发酵在600小时左右达到其稳态乙醇浓度70克/升。κ-角叉菜聚糖连续发酵时乙醇浓度在发酵过程的二个不同时间点趋于稳定，第一次在200～500小时之间达到45克/升，然后在575小时左右升至70克/升并维持此浓度直到实验结束。三种发酵系统似乎都达到了最高游离酵母细胞浓度每毫升10亿细胞左右。酵母菌细胞浓度不一致对κ-角叉菜聚糖系统的乙醇生产率有负面影响(与LCC290酵母菌系统相比初始拟稳态乙醇浓度较低)。各系统的酵母菌浓度在不同时间间隔达到峰值。对于LCC290发酵，乙醇浓度在发酵的500-1000小时之间达到其最大值；而LCC3021发酵在连续发酵的1500-2000小时之间达到最大细胞数。κ-角叉菜聚糖固化系统在连续发酵700-1000小时之间达到最高细胞浓度。三种固定化细胞发酵-LCC290超絮凝酵母菌、LCC3021中等絮凝酵母菌和κ-角叉菜聚糖固定化酵母菌的双乙酰和2，3-戊二酮拟稳态浓度并不相似。对于LCC290发酵，双乙酰为375□g/L；而LCC3021发酵水平稳定在225□g/L左右。就κ-角叉菜聚糖发酵而言，双乙酰浓度在连续发酵期中间达到500□g/L，在500小时内水平逐渐降至200□g/L左右。在三种发酵中，2，3-戊二酮浓度反映了双乙酰浓度。在整个LCC290和LCC3021发酵期间，2，3-戊二酮浓度高于双乙酰。κ-角叉菜聚糖发酵显示了不同模式，双二酰在其第一次拟稳态期间高于2，3-戊二酮，此后双乙酰浓度下跌到低于2，3-戊二酮浓度。此酵母菌浓度数据和乙醇产量数据还提示，κ-角叉菜聚糖发酵期间达到了两次分开的独特的拟稳态。
比较不同发酵系统和评估那一种更好，当此系统的优点基于一项以上标准时可能变得复杂化。例如单用总乙醇生产率作为成功的衡量标准时，所有三种测试系统评价相等，因为50升反应罐容积24小时滞留时间内均达到生产70克/升乙醇。生产可销售的啤酒比单纯生产乙醇的要求高得多。对所提出的发酵系统应根据载体的潜在性费用增加、根据载体的可利用性、系统的操作难易、环境保护(如载体丢弃)、载体的稳定性以及载体系统的灵活性，评价其生产可接受啤酒(包装乙醇生产率和双乙酰水平)的能力。为了评价这些多方面性能，商业界采用一种称为“平衡评分卡Balanced Scorecard”(Kaplan和Norton，1996)的无维度分析方法。第一步包括鉴定评价该系统所必需的标准。然后给每一标准评分(1-5分)，1分口味最差，5分口味最好。分析结束时，统计各选项总分，具有最高分的是该情况下的最佳选择。
表6.2提供了视为可用于发酵的50升试验规模气升通流管式生产反应罐可能选项的、用固定化载体的平衡评分卡的分析结果。评价了6种载体Chitopearl_脱乙酰壳多糖珠、Celite_硅藻土珠、Siran_玻璃珠、κ-角叉菜聚糖凝胶珠、中等絮凝LCC3021酵母菌和超絮凝LCC290酵母菌，主要目的是生产可销售的啤酒。用上述尺寸评价了各载体系统。总之，LCC290超絮凝酵母菌性能最佳，然后是中等絮凝酵母菌LCC3021，其它四种载体评分在16-20之间，第三位是κ-角叉菜聚糖系统，因为它以试验装置生产出了可销售啤酒。这些载体的评估强烈提示开发连续发酵系统的进一步努力应把自身聚集作为固定化模式。这类选项提供的载体的可利用性(不难获得)、费用(成本低因为不需要其它设备)、易操作(可装在工厂现有设施中)，超过了混合系统中酵母菌絮凝物的潜在不稳定性。可能利用自身聚集体对剪切力的敏感性来控制发酵过程中絮凝物的大小，并可能达到增加传质因而达到生物反应罐容积生产率的进一步提高。
表6.2 用于气升式生物反应罐系统初发酵啤酒的几种固定化载体的比较
6.6用气升通流管技术生产北美型贮陈啤酒生产口味纯正的北美(NA)型贮陈啤酒向酿酒师提出了许多挑战。NA型贮陈啤酒特征是色浅，口味不大苦，残留糖低(淡爽)，无优势香味，因而相对无余香。由于这些固有特性，酿酒师可能闻不出极少的香味缺陷。高水平的双乙酰(黄油味)、乙醛(绿苹果味)以及硫黄味(烧焦的橡皮、臭鼬味、臭鸡蛋味、烧熟蔬菜味)是最常见的烦扰当代酿酒师的问题。虽然发酵培养基的细菌污染也可能是啤酒这些不良气味的一种原因，但对发酵过程控制不当更常产生高于预料的不良气味。
实施连续发酵试验是本论文的一部分，整个试验通过勤奋实施无菌技术控制了麦芽汁和发酵容器中的污染水平。所有三种载体的发酵试验持续了几个月，未显示有可测出水平的污染(用第4章报道的方法监测)。高于所需水平的双乙酰(目标是低于30□g/L)和乙醛(目标是低于10毫克/升)使连续初发酵的产品令人讨厌，但这种水平不是因为细菌污染。这些发现与文献所报告(Pajunen等，2000，Kronlof等，2000)没有不同。一位比利时酿酒师将其连续发酵工艺生产的含高水平乙醛的啤酒转变成具销售特性，投放市场的产品为苹果味浅色啤酒(Andries等，1996b)。
酿酒业中初发酵后高含量的双乙酰也是正常的。某些酿酒商在完成其初发酵后实行一种所谓“温度自由升高(temperature free rise)”方法以帮助减小双乙酰。其他人选择将他们的产品在老化过程中简单保温较长时间使邻位二酮(双乙酰和2，3-戊二酮)降低到所需水平。另一种方法中，几个研究小组开发了第2章所述快速老化技术来处理双乙酰高含量。虽然此法很有效，但它给总酿酒工艺增加的另一种复杂性有可能难以接受。然而在酿酒业连续发酵工艺的早期，快速老化工艺的经济性相当清楚，尽量减少技术的复杂性以促进传统的分批发酵转移到连续生产，可能是明智的。因为此原因，决定研究在50升试验规模气升系统中连续初发酵后采用分批保温以控制最后啤酒中的双乙酰含量。在此博士课题开始时没有预见到要增加此加工步骤，然而必须进行这种测定以比较连续生产的啤酒和分批生产的对照啤酒。
6.6.1采用连续初发酵后分批保温确定初发酵已完成的关键性参数是终末发酵液中的双乙酰水平。双乙酰的前体α-乙酰乳酸转变成双乙酰是双乙酰途径中的限速步骤(曲线图3.5)。前一反应性质是化学反应并依赖于温度。如果“生”啤酒在α-乙酰乳酸化学转变为双乙酰前进入冷老化加工，产生的啤酒中双乙酰水平可能超过风味阈值20□g/L，除非延长冷老化时间使其前体慢慢转变。在6.5节所述三种连续发酵中反应罐所放出的双乙酰水平高于未稀释啤酒中的所需目标值30□g/L。如果在此阶段过滤发酵液去除酵母菌，双乙酰将保持高水平，因此，采用分批温热一段时间来使双乙酰值降至可接受限度之下。
收集连续发酵产生的啤酒保温在21℃的40升不锈钢啤酒罐中。定时抽取罐中液体小样品(100毫升)，并分析双乙酰、乙醇、比重、酯和杂醇。曲线图6.74显示用LCC290酵母菌作为固定化基质连续发酵产生的一批啤酒双乙酰降低与保温时间的关系。酿酒业中将能有效使双乙酰水平从约600□g/L降低至30□g/L以下的保温时间视作“预先降低(pre-drop)”界限。
另一试验研究了保温期混合对双乙酰降低的作用。通过一根1.27厘米不锈钢管将二氧化碳喷气(0.14立方米/小时)导入啤酒收集罐的底部在保温期内保持液体搅动。曲线图6.75为该实验的结果，看来CO2喷气提供的搅拌对这种次级保温罐中双乙酰降低速率几乎没有影响。此结果可能表明，CO2混合气提供的混合不充分，因此不能提高第1个化学反应(α-乙酰乳酸转变为双乙酰)的反应速率，或不能提高使第2个反应(酵母菌将双乙酰转变为3-羟基丁酮)更快发生的传质速率。也有可能没有搅拌的罐细胞悬浮充分，在发生限速的化学转化(第1步)时能进一步还原双乙酰成为无芳香的3-羟基丁丙酮。
连续初发酵后这种分批保温对罐内液体的酯和杂醇浓度、以及乙醇浓度和比重的影响分别见曲线图6.76和6.77。从这些结果看来保温期对乙醛、乙酸乙酯、丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸异戊酯的浓度几乎没有作用(曲线图6.76)。保温罐中液体的比重在保温期初12小时从2.7°P降至2.0°P，然后在此较低值上下。乙醇浓度在65小时测试期中稳定于70毫克/升，这些结果表明保温期主要影响双乙酰和2，3-戊二酮的浓度而对酯、杂醇和乙醇的影响很小。
图6.74用LCC290酵母菌在气升系统中连续初发酵后邻位二酮浓度与分批保温的关系。
图6.75用LCC290酵母菌在气升系统中连续初发酵后双乙酰浓度与分批保温的关系。
一个样品用二氧化碳喷气通入该样品搅拌，而另一样品静置不搅拌。
图6.76用LCC290酵母菌在气升系统中连续初发酵后酯和杂醇浓度与分批保温的关系。
图6.77用LCC290酵母菌在气升系统中连续初发酵后双乙酰浓度和比重与热溶保温(的关系)。
对于LCC290超絮凝酵母菌、LCC3021中等絮凝酵母菌或κ-角叉菜聚糖固定化酵母菌在50升气升生物反应罐中进行连续发酵产生的液体实行了分批保温方案。曲线图6.78提供了这三种试验的双乙酰降低曲线图。在所有三种情况下双乙酰都成功地降低至其目标值30□g/L。然而达到这种降低所需时间三种情况不同。用LCC290时大约48时实现了从600□g/L降至30□g/L，而LCC3021发酵和κ-角叉菜聚糖发酵达到此目标值只需要约24和40小时。推测这种差别与双乙酰最初的起始值有关而与所用固定化基质的种类无关。
曲线图6.79说明对LCC3021和κ-角叉菜聚糖发酵进行时间校准时与图6.78的双乙酰结果相同。对后二种发酵的原始双乙酰减少曲线进行移动使它们的初始值落在LCC290超絮凝酵母菌产生的双乙酰减少曲线上。经过这种转化，所有三种系统的双乙酰减少曲线似乎落在同一条线上。用Table Curve 2D软件，这些结果的曲线符合一级动力学方程(Levenspiel，1972)(曲线图6.80)，从以下公式可计算6.79的经校正的实验数据[双乙酰]＝648.54e(-0.0426t)(6.1)相关系数为0.96。这个结果强烈支持所有三种固定化系统显示相同的双乙酰还原能力这一理论，对此结果不应奇怪，因为双乙酰还原常与酵母菌株有关(Nakatani等，1984)。κ-角叉菜聚糖系统在其凝胶结构中固定有LCC3021酵母菌、LCC290酵母菌是一种经挑选的LCC3021菌的变异株。
一旦双乙酰水平低于目标水平30□g/L，在冷处贮藏(2℃)7天使啤酒老化，然后进行最后的产品制备(过滤、稀释充二氧化碳气和包装)。表6.3小结了在50升试验规模系统中用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌或κ-角叉菜聚糖固定化的酵母菌作为固定化基质生产出的啤酒的分析。曲线图6.81是连续生产的这些啤酒和分批产业化生产的一对照啤酒的酯和杂醇的放射(radar)图。与产业化生产的分批啤酒(对照)相比连续生产的啤酒含酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯)较低，丙醇较高，而异丁醇、伯戊醇和异戊醇较低。连续发酵产品中的乙醛水平高于对照。发泡水平、初始冷混浊、热混浊、二甲基硫、二氧化碳、二氧化硫和空气水平符合规格。
曲线图6.78用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌和角叉菜聚糖凝胶固定化的酵母菌在气升系统中连续初发酵后双乙酰浓度与分批保温的关系。
曲线图6.79用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌和角叉菜聚糖凝胶固定化的酵母菌在气升系统中连续初发酵后双乙酰浓度与分批保温的关系。LCC3021发酵和角叉菜聚糖发酵的值经时间校正至起始点与LCC290发酵相同。
曲线图6.80用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌和角叉菜聚糖凝胶固定的酵母菌在气升系统中连续初发酵后双乙酰浓度与分批保温的关系。LCC3021发酵和角叉菜聚糖发酵的值经时间校正至起始点与LCC290发酵相同。
受到将产品从其原始乙醇浓度稀释至最终浓度5.0％v/v密切影响的其它几个参数(表观浸出物、真实浸出物、计算的原始浸出物、颜色、苦味)与对照不同，因为连续发酵的产品由于其原始乙醇浓度较高(70克/升，而分批法为60克/升)需要用水作更多稀释才能达到所需的乙醇浓度。曲线图6.82是上述相同液体所含醇、双乙酰、pH颜色和苦味的放射图。醇含量、双乙酰和pH都在目标范围内，而颜色和苦味超出了规格。颜色较差与连续发酵生产的啤酒需较高度稀释有关，这可通过提高麦芽汁营养进料的颜色来纠正。苦味也是由于同样的稀释误差，也可用麦芽汁进料纠正。
表6.3 用气升系统生产的啤酒分析的小结
图6.81在气升系统中用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌或固定在角叉菜聚糖凝胶珠的LCC3021酵母菌连续发酵生产啤酒的放射图。此图提供了最终啤酒的酯和杂醇情况。所有产品在初步发酵期后经受分批保温。
图6.82在气升系统中用LCC290酵母菌、LCC3021酵母菌或固定在角叉菜聚糖凝胶珠的LCC3021酵母菌连续发酵生产啤酒的放射图。此图提供了最终啤酒的酯和杂醇情况。所有产品在初发酵期后经受分批保温。
6.6.2最佳喷气的选择大多数酿酒房中不难获得二氧化碳，因为它是酵母发酵的天然副产品。酿酒房收集产生的CO2，然后洗涤此气流除去其中可能带入收集气体中的少量杂质(通常为含硫化合物)。然后将这种纯化的气体压缩成液体并贮存待酿酒房使用(99.95％纯)。在连续发酵中用CO2作为喷气从操作观点看似乎是一种合乎逻辑的选择。工厂能利用他们的收集系统回收离开连续发酵罐中的CO2。而采用其它气体只会增加此现有工厂操作的另一种复杂性。
然而，连续发酵要切实可行地代替目前的分批生产法，必须生产出与当前品牌啤酒密切相配的产品。相信在连续发酵过程中如果使酵母菌接触的生物学/生物化学作用尽可能减小，也许可能实现这种相配产品。已知在初发酵中CO2对酵母菌代谢有不良影响。在高的圆锥形罐中(该系统固有的排出压力抑制液体培养基中的CO2自由释放)这种作用被放大。这些情况倾向产生含有较低酯类和较高杂醇的啤酒。已进行了成功的尝试通过定时从圆锥形罐底部注入辅助气体去除发酵中的一些这种CO2。这种CO2抑制的作用看来已降低，所得产品中含有较少杂醇和较高的酯类。
由于这种知识的增加，研究了在气升系统中用氮气代替CO2作为喷气。收集了50升气升反应罐中的几种发酵液并在Labatt酿酒实验室中用以下步骤加工。收集反应罐(24小时滞留时间)液体14小时后，从酵母菌上倾析出“生啤酒”，使其经过48小时室温(21℃)保温，让双乙酰和乙醛达到Labatt的技术规格(双乙酰＜30□g/L，乙醛＜10毫克/升)。然后使这种液体冷老化7天并用标准化工业规程加工。
表6.4将用LCC290酵母菌在CO2喷气系统和N2喷气系统中连续发酵得到的最终啤酒的结果与标准工业化生产的啤酒(对照)进行了比较。喷氮气的啤酒口味优于产业化生产的啤酒液。分析表明此酒中1-丙醇高达2倍而二甲基硫浓度大约低三倍，颜色和苦味评分值看来高于工业生产的酒，发泡能力用NIBEM试验测定也如此。CO2喷气产生的啤酒比N2喷气产生的酯类(乙酸乙酯、乙酸异戊酯)含量低而1-丙醇含量高。计算了对照啤酒、N2喷气啤酒和CO2喷气啤酒的酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯)与杂醇(1-丙醇、异丁醇、异戊醇)的比率，发现分别为0.30、0.27、0.15。
表6.4 用装载有LCC290超絮凝酵母菌的气升系统连续发酵生产的几种产品化学分析小结
图6.83提供这些啤酒的酯类、杂醇和乙醛浓度的放射图。除了丙醇含量较高外喷氮气啤酒的模式十分接近对照啤酒。CO2喷气发酵显示低得多的酯类和与对照不相配的杂醇。两种连续发酵啤酒的双乙酰和乙醛水平低于labatt技术规格。
以上发现提示喷氮气提高了酯类产量，其水平与商品啤酒相似，而喷CO2产生的啤酒酯类浓度较低。这些结果提示在CO2喷气环境中酵母菌代谢发生改变。不论喷什么气，连续发酵啤酒中的丙醇含量比工业化发酵对照啤酒高得多。虽然丙醇浓度低于风味阈值100mg/L，但注意到与分批发酵相比这些差别可能是连续发酵中代谢发生了轻微变化的一种指标。也可能较高的丙醇含量是由于不断提供的苏氨酸，其可通过氧代酸降解途径产生丙醇。
图6.83喷氮气和喷CO2连续气升发酵啤酒与工业化生产啤酒的酯类和杂醇相比较的放射图。
第七章 结论可从本文所作的研究得出以下结论。用50升试验规模气升通流管式生物反应罐进行连续初发酵，再经过2天分批保温以控制双乙酰，可生产出可被接受的无重要口味缺陷的啤酒。最少滞留时间24小时或每天1次反应罐容量周转对将高比重麦芽汁(17.5°P)发酵成为最终发酵液(2.5°P)是可实现的。超絮凝酵母菌LCC290中等絮凝酵母菌LCC3021和κ-角叉菜聚糖固定化酵母菌均是可用于该气升系统的适宜载体。较重的预先制备的载体如siran玻璃珠和Celite硅藻土珠不是气升通流管系统中实用的替代物。可实现κ-角叉菜聚糖凝胶珠连续发酵至少2个月，LCC290和LCC3021连续发酵至少3个月而无任何实验性微生物污染或反应罐性能不稳定。此外，该连续发酵系统能够应付长期运转过程中产业化麦芽汁供给中可能发生的变化。
用超絮凝酵母菌LCC290和喷氮气连续发酵，然后进行2天分批保温，产生了口味与工业生产对照啤酒最为匹配的啤酒。设计用2天分批保温来处理从连续初发酵罐排出的液体中的高浓度双乙酰是有效的，虽然不是最优的控制方法。三种测试的连续发酵系统还原双乙酰的能力很相似，如先前怀疑的那样，这种性能可归因于菌株类型。分批保温期不影响保温期中啤酒的酯类和杂醇浓度。在喷气中含3％氧气给麦芽汁提供充足的氧，结果整个发酵过程中酵母菌群存活力维持在90％以上，而生产的啤酒具有可为人们接受的口味。用酵母菌LCC290和LCC3021作为固定化基质连续发酵比用κ-角叉菜聚糖凝胶珠系统能更快地达到拟稳态。κ-角叉菜聚糖凝胶固定化发酵的不稳定性可能是因为固定化酵母菌群增加导致产物发酵低于目标水平。对于理想的连续生产，此现象是很不理想的，因为在灾难性失败后延期启动增加了反应和重新开始所需时间。延长启动期还要求更长的连续发酵期以吸引人。
此连续凝胶珠生产工艺生产出了用于在试验规模反应罐中试验的所需数量的珠。然而，必须进一步优化此珠生产工艺以生产出大小分布更狭的珠。还需要进一步研究此工艺以确定其工业规模的可行性。除了本研究中研究了Kenis类型外，为使这种选择切实可行，必须找到并测试通过增加直径而不只是增加固定混合器数目，而实现扩大生产规模的一种新型固定混合器。
本文中采用了酸脉冲示踪技术，使我们得以评估LCC290超絮凝酵母菌、LCC3021中等絮凝酵母菌和κ-角叉菜聚糖固定化酵母菌实际发酵期间50升试验规模生物反应罐中的混合时间和循环速度。此混合数据与衰减的正弦函数相符，由该函数可计算出混合时间和循环速度。
在该气升通流管系统中进行快速混合，对所有三种固定化载体计算的混合时间少于200秒。所有三种测试系统的表面气体流速提高时混合时间略有减少。在所有测试的表面气体流速(2～6毫米/秒)时，LCC290系统显示最快的混合时间(100～120秒)。不论表面气体流速，所有三种载体的液体循环时间非常相似，它们也随气体流速的相应增加而线性下降。所有测试的固定化载体在3～6轮反应罐循环中完成了液体混合(对一次脉冲的98％的反应)。这些结果证实试验的50升试验规模系统为连续发酵提供了充分的混合。混合时间小可能出现死角而对啤酒发酵不利。
本博士研究工作清楚的证明，进一步扩大在Labatt酿酒实验室中设计、构建和该生产系统的规模是可行的。推荐采用装有LCC290超絮凝酵母菌和喷氮气的气升通流管生物反应罐(初步)连续发酵，然后于21℃分批保温作为首选的系统。
发明详述——第二部分第4章 材料和方法4.1酵母菌株和特征整个工作中采用贮陈酿酒酵母菌株Labatt Cultrue Collerction(LCC)3021。酿酒酵母菌与葡萄汁糖酵母卡尔斯伯变种(Saccharomyces uvarum Beijerinck varcarlsbergensis Kudryavtsev，1960为同义词(Kurtyman，1998)。LCC3021在37℃时不生长。这有助于鉴别LCC3021贮陈酵母菌与大多数浅色(啤酒)酵母菌，后者可在37℃和更高温度下生长。LCC3021是一种底层发酵菌株，大部分贮陈酵母菌也如此，但有例外。还有，该菌株能发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖和蜜二糖，但不发酵淀粉。发酵蜜二糖的能力也是分类学家鉴别它与浅色酵母菌所用的一种方法。与大多数酿酒菌株一样，LCC3021为多倍体，通过有丝分裂繁殖。在正常酿酒条件下贮陈酵母菌不通过减数分裂增殖，这个优点使酿酒菌株在遗传上稳定，因为遗传物质不大可能发生交换(Kreger-van Rij，1984)。
4.2酵母菌接种物制备取-80℃冰箱活的冻存的酵母菌在蛋白胨-酵母膏营养(PYN)琼脂(蛋白胨3.5g/L，酵母膏3g/L，KH2PO42g/L，MgSO47H2O，1.0g/L，(NH4)2SO41.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，溶于水)生长培养基上划线接种，获得分离良好的菌落，从生长3-4天的酵母菌平板中挑一无菌环(含几个菌落)接种在面10ml麦芽汁试管中。于21℃培养过夜称为“过夜培养物”，然后加到较大量(常为200ml)的麦芽汁中以增加酵母菌量。在以后几天，将此混合物加到另一更大体积的麦芽汁中，直到繁殖得到所需的酵母菌量。通常预计每升麦芽汁可产生大约20克贮陈酵母菌。为了制备酵母菌接种物，于4℃以10000rpm(半径0.06m)离心培养物10分钟。离心后倾弃液体，从沉淀中得到适当湿重的酵母菌供接种。
4.3麦芽汁发酵培养基加拿大Labatt酿造所提供了比重17.5°P的酿酒麦芽汁。附录A2.1中给出了用于本研究发酵的该麦芽汁中的可发酵糖类的浓度、比重和游离氨基氮。该麦芽汁组成的其它详细说明见Dale等，1986，Hoekstra，1975，Hough等，1982，Klopper，1974和Taylor 1989。
分批发酵麦芽汁经100℃45分钟加热灭菌，然后冷却，然后用固定化细胞珠或游离悬浮的酵母菌接种连续发酵用于连续发酵的麦芽汁在加入气升生物反应罐前用瞬间巴斯德法消毒灭菌(Fisher Plate Heat Exchanger，combi-flow Type Eurocal 5FH)。定期如4.6所述监测麦芽汁的细菌污染。如果在麦芽汁中测到污染立即丢弃并从该厂收集新的麦芽汁。瞬间巴斯德消毒器的体积流速为0.8立方米/小时。有一管道式保温室，麦芽汁在其中保留于平均温度85℃，最低温度为80C。保温室容积1.13×10-2立方米，在室中滞留时间51秒。加热后麦芽汁在其中迅速冷却离开时为2℃。
4.4固定化方法κ-角叉菜聚糖凝胶X-0909由哥本哈根Pectin A/S赠送。如Neufeld等(1996)所详述，用固定混合器工艺生产包埋贮陈酵母细胞的κ-角叉菜聚糖凝胶珠，最初细胞负荷为每毫升凝胶107-108个细胞，各次实验均详细说明。如图15所述固定混合器工艺的依据是用在线聚缩醛固定混合器(Cole-Parmer Instrument Co.，USA)在非水连续相植物油(Mazola Corn Oil)和水分散相接种有酵母菌的κ-角叉菜聚糖(3％v/v溶于0.2％w/v KCl溶液)溶液之间形成乳液。在图解说明的加热室中酵母菌与角叉菜聚糖溶液迅速混合，在37℃时形成乳液。在冰浴中快速冷却诱导乳液中的κ-角叉菜聚糖液滴胶凝，然后在KCl浴(22克/升)中变硬。用24构件固定混合器(直径6.4毫米)产生酵母菌和角叉菜聚糖混合物。用第二套42件12.7毫米直径的混合器产生乳液。本研究实验中用的珠径大于0.5毫米，小于2毫米。
4.5包含固定化酵母菌细胞的κ-角叉菜聚糖凝胶珠的颗粒大小累积分布在30升凝胶珠生产过程中随机采取κ-角叉菜聚糖凝胶珠样品以计算以物质湿重为基础的粒度分布。每次采样均约500克湿重，采用过筛方法确定珠粒度分布。使珠通过网孔2.0、1.7、1.4、1.18、1.0和0.5毫米的一系列筛网。用4.5升22克/升的KCl液加快各珠样品过筛。假设κ-角叉菜聚糖凝胶珠是完整的球形，故彩筛孔直径作颗粒直径。还假设颗粒密度均匀，与粒度无关。
4.6酵母细胞计数和存活力测定游离悬浮的酵母菌的存活力和细胞浓度，采用美国酿酒化学家协会(ASBC)国际性亚甲蓝染色技术(Technical Committee and Editoriod Committee of ASBC，1992)测定酵母细胞的存活力。此染色法测定酵母菌群是活是死是根据活细胞氧化该染料成为无色形式的能力。死细胞缺乏氧化该染料的能力因而染成蓝色。制备Fink-Kuhles亚甲蓝缓冲液的方法是将500ml A液(0.1g亚甲蓝/500ml dH2O)和500ml B液(13.6gKH2PO4/500ml dH2O 498.65ml与2.5g Na2HPO412H2O/100ml dH2O 1.25ml)混合，产生pH4.6最终亚甲蓝缓冲液。
在试管中混合稀释的酵母菌液和亚甲蓝液成为悬液，使显微镜视野中约有100个酵母细胞的悬液。取一小滴混合均匀的悬液置于显微镜载玻片上，盖上盖玻片。与染液接触1-5分钟后计数蓝染和无色细胞。活细胞百分比报告为总细胞数的百分比。用光学显微镜和血细胞计数器(Hauser Scientific Company)测定细胞浓度。
固定化细胞的存活力和细胞浓度使发酵液通过无菌筛网(网孔经500微米)从发酵液中分离出凝胶珠并用10毫升蒸馏水淋洗，将含有包埋的酵母菌的1毫升凝胶珠加入装有19毫升蒸馏水的灭菌的50ml样品容器中。然后用Polytron_装置(Brinkmann Instruments)破坏珠，从凝胶释放出细胞。如上述游离悬浮细胞那样测定细胞存活力和浓度。
4.7微生物学分析液相分析每周至少一次取连续发酵的样品作微生物分析。在连续发酵所用的麦芽汁输送入生物反应罐中之前也检测其中的污染。为了测定是否存在需氧和厌氧菌，将样品接种在加有10mg/L放线菌酮的Universal Beer琼脂(UBA，Difco Laboratories)平板上，28℃培养10天。将用于检测厌氧菌污染的平板置于带有AnaeroGen_(Oxoid)夹套的厌氧罐中，此夹套可吸取罐中残余的氧气产生厌氧环境。采用存在氧时变成粉红色的厌氧指示剂(Oxoid)来验证罐中的厌氧状态。将样品接种在加CUsO4(0.4g/L)r酵母菌培养基(YM琼脂，Difco Laborafories)上25℃培着7天，检测野生酵母菌污染。采用前面所述蛋白胨酵母膏营养琼脂(PYN)于37℃培养7天筛检样品中的非贮陈酵母菌污染。37℃在PYN上不生长酵母表明没有浅色(啤酒)酵母菌或不存在37℃能生长的污染菌。
凝胶相分析我们实验室开发了一种试验来确保用于发酵的固定化细胞珠在投入生物反应罐前没有污染细菌。主要关注避免被啤酒腐败菌如Pediococcus属和Lactobacillus属菌或野生酵母菌所污染。将3毫升角叉菜聚糖凝胶珠接种入100ml几种下述的几种不同选择性液体培养基中，在25℃放在250ml烧瓶中，于培育摇床中100rpm振荡培养。NBB肉汤(Nachweis von Bierschadlichen Bacterien)(BBL cat#98139，NBB Broth，Base 0.02g/L放线菌酮)是一种用于检测啤酒腐败菌的半选择性培养基。硫酸铜肉汤(16g/L YM broth，Difco；0.4g/L CuSO4)是一种检测野生酵母菌污染的半选择性培养基。最后，标准方法(STA)加放线菌酮肉汤(16g/L“StandardMethods”broth，Difco；0.02g/L放线菌酮)用于检测水、废水、乳制品和食品中发现的细菌(Power and McCuen，1988)。选择此选择培养基，可在三天中检测和鉴定潜在的啤酒腐败菌。样品有混浊表明样品已污染并作出污染物身份推定。
呼吸缺陷(RD)型酵母菌细胞检测方法氯化三苯基四氮唑(TTC)覆盖技术用此法鉴别呼吸缺陷型酵母菌与其余酵母菌，其依据的原理是TTC是一种无色盐，还原时形成红色沉淀。当将TTC覆盖到在酵母膏-蛋白胨-葡聚糖(YPD)琼脂(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡聚糖20g/L，琼脂20g/L用dH2O配)上生长的酵母菌落时，呼吸充足的酵母菌将还原TTC，这些菌落变成深粉红或红色，然而呼吸缺陷型酵母菌不能还原此染料，而保持其原先颜色。
系列稀释培养物至细菌为适当浓度(约100个细胞/0.2毫升)，进行平板接种，然后21℃培育YPD平板约3天直到在需氧环境中看见酵母菌落。各平板覆盖20毫升50℃的TTC覆盖琼脂。将各溶液冷却至50℃后，混合A液(12.6g/L NaH2PO4；11.6g/LNa2HPO430.0g/L琼脂，在dH2O中，121℃15分钟灭菌)与B液(2.0g/L氯化2，3，5-三苯基四氮唑的水溶液，121℃15分钟灭菌)制备TTC覆盖琼脂。室温培育3小时后读板。RD百分比报告为观察总数中未染色菌落的百分比。
4.8κ-角叉菜聚糖凝胶珠中固定化酵母菌的扫描电镜观察(SEM)通过取样孔从生物反应罐中取出含固定化酵母菌的κ-角叉菜聚糖凝胶珠，置于10ml螺纹盖玻璃管瓶中，使珠浸没在少量发酵液中。立即用冰覆盖玻璃管瓶并装在绝热容器中转运至SEM场所。用0.07M pH6.8的Sorensen磷酸缓冲液(Hayat 1972)配制的2％(v/v)戊二醛固定含固定化酵母菌的κ-角叉菜聚糖凝胶珠，然后用同一缓冲液配的1％(w/v)四氧化锇固定，通过系列梯度50、70、80、90、95、100％(v/v)酒精溶液脱水各15分钟，然后以100％酒精换液三次。通过CO2进行临界点干燥(LaddResearch Industries Burlinton，VT)之前将一些珠在液氮中冻结、破碎、收集在100％酒精中。冷冻破碎使珠的内面暴露出来但变形极小。临界点干燥后将样品溅射涂膜30纳米的金/钯(Polaron SC500sputter Coater，Fison Instruments，England)，然后用Hitachi S-4500场致发射扫描电镜(Nissei Sangyo，Tokyo，Japan)扫描。
4.9生物反应罐取样方法将生物反应罐取样口(Scandi-Brew Type T Membrane Sample Valve)储器灌满70％(v/v)乙醇溶液以保持各次取样之间开口周围的无菌状态。为取样，取下乙醇储罐底部的塞子，排空并用乙醇彻底淋洗，打开取样孔。将样品收集到一咬边管瓶中或一带螺纹盖的罐中，容积5-60ml不等，取决于所需分析。为检测微生物污染，使10ml发酵液用真空泵通过一无菌膜滤器。此膜孔径0.45□m，如4.6节所述放置在适当的选择性培养基中。
为进行化学分析，通过隔膜从100ml密封咬边管瓶中抽取60ml样品，通过Schleicher and Schull，FP-050双层针筒滤膜系统进行针筒过滤，此滤膜孔径为5□m和0.45□m。然后将所需体积的样品分装入20ml顶空的管瓶中，该管瓶中有一Teflon隔膜和铝盖。需要的样品体积列于表4.1中表4.1 各种化学分析所需的样品体积
4.10溶氧测定Thiedig博士的Digox 5溶氧分析仪检测麦芽汁、发酵麦芽汁和啤酒中溶氧的范围为0.001-19.99mg/L(Anon，1998)。Vilacha和Uhlig(1985)试验了测定啤酒溶氧的许多仪器，发现Digox分析仪得出真实有价值的精确值。Digox 5所用的电化学测定法基于电热表测定电流的三电极安排。检测小室由一测定电极(阴极)和反电极(阳极)组成。这些电极暴露于待测定其中氧浓度的液体中。固定一规定的测定电势后，在测定电极处发生反应。在大的银测定电极处氧分子还原成羟基离子。反应4.1中两个水分子与一个氧分子反应，同时吸收4个电子产生4个羟基离子(4.1)不锈钢阳极吸收阴极释放的4个电子以确保电流流过。反应式4.2中，测定的电流I与氧浓度CL，O成正比I＝K×CL，O(4.2)其中常数K受法拉第常数、每分子转化的电子数、阴极表面积和测定电极表面边界层深度的影响。恒定的特征测定电势是测定的选择性(对氧)和精确性的关键因素。通过一不负载电流的参比电极使测量电压稳定。这样与提供电子反馈的静电势一起，提供了恒定的测定电势。测定电极的表面通过一薄膜与参比电极电解相连。
根据最终溶氧浓度的测定范围，误差为±3％(Anon 1998)。用Thiedig ActiveCalibration校正溶氧分析仪，Thiedig Active Calibration中Digox 5依据法拉第定律产生一规定量的氧(0.5mg/L)，然后将其与基质的测定值反复核对。这使得此仪可在1分钟内根据压力、温度和对应于测定的这些(参数值)的流动情况进行校正，由于传感器中分子的交换是一种扩散过程，受温度影响，导致较快的反应速度和测定电流的升高。因此Digox 5也装置了一传感器来测量温度并自动补偿温度的波动。
Digox 5有某些优点超过以膜为基础的氧传感器。因为Digox 5不采用电解液，灵敏度损失相当慢，测定电极上只发生很少沉积。还有，任何时间可通过主动校正来确定灵敏度。清洗和重校正此仪器方法简便。大多数膜传感器中氯化银沉积在阴极上及电解液变化会导致读数逐渐降低。为此推荐每隔数周更换膜和电解液并重新校正。这是一项冗长费力的任务。校正膜传感器，实验室常在氧饱和水平时进行，这可能产生明显的误差，特别是在麦芽汁和啤酒基质氧含量很低时。温度对膜传感器有三重影响膜通透性变化，氧分压会变化，电解液中的氧溶解度会变化。对膜传感器的这三种因素进行温度补偿很困难。
储存期麦芽汁中的溶氧测定将可弯曲的Tygon_食品级管道(内径1/4英寸)与位于麦芽汁储罐T1或T2锥底顶端附近的采样口无菌相连(见4.2.1节)。一台可调速度的蠕动泵提供11升/小时的体积流速通过溶氧分析仪区(Masterflex_L/STMDigitalStandard Drive，Cole-Parmer cat#P-07523-50)。4-5分钟后记录麦芽汁溶氧测定值。
生物反应罐中的溶氧测定。在进行生物反应罐中溶氧测定前清洁Digox 5分析仪区，将传感器入口连接灭菌的Tygon_食品级管道子(内径1/4英寸)，以大约10升/小时的体积流速将70％(v/v)乙醇液泵入通过该分析仪15分钟。将溶氧分析仪连接至实验室自来水，使热水(70℃)通过传感器至少2小时。采用此法而非蒸气灭菌是因为分析仪区材料不能耐受70℃以上温度。两小时清洁后，夹住出入口的管子以保持分析仪内无菌。在一层流通风橱内将刚灭菌的管子与分析仪的出入口连接。然后将该管子的游离端无菌连接(用夹子)于生物反应罐顶板上1/4英寸内径的不锈钢孔，进行测定。当不用生物反应罐的此孔时，用一段短的灭菌Tygon_食品级管子密封。通过位于生物反应罐顶板的一孔收集发酵液，在线测定气升生物反应罐中的溶氧。发酵液通过一连接于穿过生物反应罐顶板的1/4英寸不锈钢管的不锈钢滤器(见4.1.2节)流出。发酵液然后流经可弯曲的Tygon_食品级管子(1/4英寸内径)，该管子连接至一台可调速度的蠕动泵(Masterflex_L/STMDigital Standard Drive，Cole-Parmer cat#P-07523-50)，提供11升/小时的体积流速通过溶氧分析仪区。发酵液通过穿过生物反应罐顶板的第二个1/4英寸不锈钢口再循环。采用Tygon_食品级管子(Cole-Parmer，1999)连接传感器与生物反应罐，因为供货商说明其具有30cm3mm/(s·cm2·cmHg)×10-10的低氧渗透性。循环4-5分钟后进行测定。
4.11化学分析用适当的标准试剂进行校正。用于此分析的所有试剂纯度大于99％。需要时通过蒸馏进一步纯化。
4.11.1乙醇采用美国酿酒化学家协会技术委员会和编辑编员会的内部标准气相色谱(GC)法(1992)测定乙醇浓度。脱气样品直接用异丙醇内标5％(v/v)处理，注入装有火焰离子化检测器(FID)和Dynatech自动取样器的Perkin Elmer8500气相色谱仪中。采用Chromosorb 102，80-100目柱，以氦作为载气。色谱条件流速20ml/分钟，注射器温度175℃，检测器温度250℃，柱温185℃。
4.11.2糖概要用装有阳离子交换柱(Bio-Rad Aminex，HPX-87K)和折射率检测器(Spectra-Physics SP6040XR)的Spectra-Physics(SP8100XR)高效液相色谱仪(HPLC)，测定发酵样品中的葡萄糖、果糖、麦芽糖、DP3(麦芽三糖)、DP4(麦芽四糖)、多糖峰1和甘油浓度。流动相为磷酸氢二钾0.01M。该系统装有Spectra-Physics(SP8110)自动取样器，仪器以反压800psi操作。通过柱的样品和洗脱液流速为0.6ml/分钟，柱温85℃，检测器温度40℃，注射体积10微升。
4.11.3比重本研究用真实浸出物(Plato度，°P)描述麦芽汁和发酵培养基的比重，它是用于酿造业的公认单位。如4.8节所述过滤发酵样品，振荡混合然后用数字密度计(AntonPaar DMA-58密度计)分析测定麦芽汁比重(°P)。将发酵样品注入玻璃U形管，电子振荡测定比重，直接得出°P。Plato度指20℃时蔗糖水溶液百分比(w/v)的数值，其比重与所述麦芽汁相同。由于Plato度的分度和所得的溶液比重与溶质浓度相关表是基于蔗糖水溶液，它只是浸出物数量的近似性。浸出物这个词是指，酿酒材料中存在和/或可能通过加工得到的可溶性物质总量(Hardwick，1995)，如糖类、蛋白质、单宁等。目前浸出物在酿造业仍以Plato度为单位的比重表达，因为缺乏与不同来源的麦芽汁组分的变异更好相关的更适当参考值。
4.11.4总双乙酰量啤酒和发酵样品中的总双乙酰(2.3-丁二酮)量用美国酿造化学家协会技术委员会和编辑委员会(1992)的方法为基础的顶空分析物取样技术，然后通过毛细管GC分离(Hewlett-Packard5890)和电子捕获检测(ECD)。此法测定“总双乙酰”，因为此法测定的是双乙酰及其前体α-乙酰乳酸的量。载气为含5％甲烷的氩气(1.0ml/分钟)，采用J amp; W DB-Wax柱。分流比2∶1，辅助气体为氦，60ml/分钟。注射器温度105℃，检测器温度120℃。此系统装有Hewlett Packard 7694E顶空自动取样器，用2，3-己二酮作为内标。样品循环时间40分钟，管瓶平衡时间为65℃，30分钟，4.8psig加压时间2分钟，环充填时间0.2分，环平衡时间0.1分，注射时间0.27分钟。载气压18.8psig，输送管道温度95℃，环温65℃。
4.11.5啤酒的挥发物用内标(n-丁醇)GC(Hewlett Packard 5890)顶空方法和火焰离子化检测器(FID)测定啤酒的挥发物，包括乙醛、乙酸乙酯、异丁醇、1-丙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯。载气为氦，6.0ml/分钟，GC装有Hewlett Packard 7694顶空取样器。GC注射器温度200℃，检测器温度200℃，炉温变化曲线40℃5分钟，40-200℃(10℃/分钟)，200-220℃(50℃/分钟，220℃5分钟)。FID气体包括载气6.0ml/分钟，组成为氦气30ml/分钟和28psig，氢气50ml/分钟和25psig，空气30ml/分钟和35psig。以流速0.8ml/分钟清洗隔膜。压头4.0psig。当自动取样器通过注射口中的针头相连时，管瓶压力为15.9psig，载气压力为7.1psig，柱顶压4psig，分流速18ml/分钟，柱流速6ml/分钟。区带温度管瓶70℃，环80℃，输送管道150℃。GC循环时间40分钟，管瓶平衡时间35分钟，加压时间0.25分钟，环充填时间0.1分钟，环平衡时间0.1分钟，注射时间3分钟，样品环容积1ml。
4.11.6游离氨基氮(FAN)采用美国酿造化学家协会技术委员会和编辑委员会的游离氨基氮国际方法(1992)测定发酵样品中的游离氨基氮浓度，使用Perkin Elmer LS50B分光光度计，该分光光度法显示茚三酮和样品中所含氮之间的颜色反应。吸光度值与存在的游离氨基氮量直接相关。
a)显色试剂 19.83g Na2HPO430.00g KH2PO42.78g 一水合茚三酮1.50g 果糖b)稀释试剂 2.00g KIO3596ml 蒸馏的去离子水404ml 95％(v/v)乙醇贮存于冰箱中并在室温应用c)甘氨酸贮液0.1072g/100ml蒸馏的去离子水d)甘氨酸标准液，将该贮液用蒸馏的去离子水稀释至1∶100(v/v)。此标准液含2mg/L FAN。
用蒸馏水稀释样品至100∶1，将2ml稀释的样品移入3个试管中的每一个。另三个试管各装2ml蒸馏的去离子水作为空白。同时制备各含甘氨酸标准液2ml的三个试管。向所有样品加入1ml显色试剂，然后置于100℃水浴中准确放置1分钟。然后将试管以20℃水浴冷却20分钟。然后在每一试管中加5ml稀释度剂，充分混合。然后让样品静置10～15分钟。用分光光度计测570纳米的吸光度值，用公式4.3计算样品的FAN量FAN(mg/L)＝(AP-AB-AF)2d/As (4.3)其中FAN为样品中游离氨基氮的量mg/L。AP为测试液的平均吸光度值，AB为空白液的平均吸光度值，AF为校正深色麦芽汁和啤酒用的平均吸光度值，2是甘氨酸标准液中的FAN量，d是样品的稀释倍数，AS是甘氨酸标准液的平均吸光度值。
第五章 用气升生物反应罐系统连续发酵啤酒连续发酵生产选用气升通流管式生物反应罐系统是因为其优良的传质(液-固)和混合特性。特别重要的是液-固传质，因其涉及从液相输送营养物给固相固定化细胞生物催化剂，为包埋的酵母菌提供了发酵底物，这些生物反应罐也提供了良好的通气，能耗低，且结构简单。这使得气升式生物反应罐对大规模操作如用于商业化废水处理很有吸引力(Driessen等，1997，Heijnen1993)。
5.1气升通流管式生物反应罐说明此节详述本项工作所用的气升式反应罐5.1.1生物反应罐机体为本工作设计的13升(8升工作体积)气升通流管式生物反应罐是一种三相流化床(液/固/气)，其中通过喷二氧化碳气驱动罐内液体循环使固定化细胞保持悬浮(Heijnen，1996)，见图16。生物反应罐容器照片见图17。附详细尺寸的详细草图见图18。二氧化碳和空气通过一长0.11米，外径0.013米的烧结不锈钢喷雾器(CO2purgernozzle，Part#9222，Hagedorn amp; Gannon，USA)进入生物反应罐锥形底。用CO2作为流化气体，用空气向酵母细胞供氧。一通流管位于生物反应罐柱体内部中央，功能是该流化床系统内的升气管而外部环隙起着降液管作用。内部通流管从圆柱形颗粒分离器下悬，位于生物反应罐扩大的顶部区域中的三片不锈钢翼片上。保持此通流管和颗粒分离器部件位于生物反应罐内，最大程度减少了来自外环境的微生物污染的危险。原先该反应罐出口处有一筛网用于分离固定化细胞与液体。然而此筛网易堵塞故用不锈钢柱，当固定化细胞珠与液相从通流管顶部沿环隙向下移动时分离它们。颗粒将撞击柱体并向下落回液相中而不会溢流离开反应罐。这样在反应罐出口附近有一小区域没有固定化细胞的颗粒，此反应罐顶部扩大也增加了气体气泡分离的表面积。
5.1.2生物反应罐顶板图19是该生物反应罐顶板模式图。顶板孔保持最小以减少污染危险，孔直接焊接在顶板上或采用压缩式管接头(Swagelok_)。此顶板装有一接种孔、温度计插孔和温度计，用于气体取样的隔膜和溶氧测定取液孔和返回孔。一温度传感器插在温度计插孔中反馈给温度控制系统。温控仪反馈至电磁阀。该阀门可打开和关闭对生物反应罐保温夹套的乙二醇供应。用温度计(Cole-Parmer Waterproof ThermocoupleThermometer，#90610-20)和焊在反应罐顶板的T型探头监控温度。溶氧测定采用溶氧分析仪(Theidig博士的Digox 5)，对于精确的氧读数，要求通过分析仪区域的液体肉汤流速为9-11升/小时。通过一根经顶板伸入发酵液的内径1/4英寸的管从反应罐中吸取液体作溶氧测定。如图20所示，此管的尖端附有一滤器，当液体泵入溶氧分析仪时可从液体中去除较大颗粒，然后液体通过顶板中的另一1/4英寸孔返回生物反应罐。
5.1.3无菌取样用阀门的清洁该生物反应罐装有焊在罐壁中的膜取样阀(Scandi-Brew_)。设计此阀门用于在无菌条件下取样。此膜直接将发酵液密封，使阀门可用蒸气和酒精通过二个出口完全灭菌(图18)。此膜附近在外面有一小的酒精储器室保持几次取样之间无菌。此种阀门用于所有生物反应罐采样，并假定采样点的液体组成与反应罐出口处流出的液体组成并无显著不同。如本文材料和方法章中所述，从位于罐外壁处的阀门采样。为了验证罐出口处流出的液体的组成与从罐体采样的液体相同这一假设，进行了混合时间研究。
用脉冲示踪法测定气升式生物反应罐的混合时间(Chistie，1989)。将1ml 10N HCl迅速注入生物反应罐环隙，记录pH随时间的变化。其中时间t＝0秒为注射时间。注入10N NaOH使pH返回其原始数值。pH电极(Cole-Parmer，cat.#P-05990-90)长277毫米、直径3.5毫米。用Ingold 2300 Process型pH发送器监控pH。用经检定的标准缓冲液Beckman pH7.0绿色缓冲液Part#566002和Beckman pH4.0红色缓冲液Part#566000进行二点pH校正。用Cheryl Hudson和John Beltrano 1994年设计的经Norm Meusour1999年改进的软件程序(University of Western Ontairo，London，Ontario)以3750Hz的频率记录30秒的数据。
然后用TableCurve 2D中的Savitsky-Golay算法(Jandel Scientific Software，Labtronics Guelph，Ontario)校平此pH数据。Savitzky-Golay算法是一种根据pH数据内穿过移动窗口的最小二乘方四次多项式拟合法的校平时间域方法(Anon，1996)。然后将校平的数据归一化并产生ΔpH与时间的图。当pH达到平衡值的～95％时，取最按近的一分钟作为混合时间。用三种不同体积流速的二氧化碳气283cm3/分钟、472cm3/分钟(整个此项工作用的体积流速)和661cm3/分钟，测定混合时间。在所有三种情况下，反应罐中的pH在不到二分钟内达到平衡(截止于～95％)，见附录1。据信混合时间足够短，验证了我们最初反应罐中混合良好的假设。这使我们得以假设从反应罐壁采得的液体样品其组成与从出口流出的在罐中平均带留24小时后的液体组分没有显著不同。从附图可见分散叠加在气升生物反应罐典型的混合上的明确的液体再循环(Chisti，1989)。
5.2连续啤酒发酵系统的流程21为安置在Labatt酿造有限公司(安大略州伦敦)的小型酿酒试验工厂中的连续啤酒发酵系统的流程图，其详细部件说明见表5.1。简言之，从伦敦Labatt工厂收集酿酒用麦芽汁，用瞬间巴斯德消毒器(Fisher Plate Heat Exchanger，Combi-flow typeEurocul 5FH)灭菌，存入大贮罐(T-1和T-2)中。连续发酵期间，以控制的流速将麦芽汁输送入装有固定化酵母细胞的气升式生物反应罐(BR-1)中。发酵液溢流离开反应罐收集在一接受罐(T-3)中。以下各节详述图21连续啤酒发酵系统的操作。
5.2.1麦芽汁收集和贮存从Labatt伦敦工厂经管道收集连续发酵用的未加氧的麦芽汁到1600升圆锥形贮罐中，该贮罐预先用二氧化碳气清洗使麦芽汁吸收的氧极少。所有这种规模的罐，包括麦芽汁贮罐T-1和T-2都按Labatt规程在使用前清洁和消毒。麦芽汁然后用瞬间巴斯德法灭菌，于2℃转移到准备好的麦芽汁贮罐T-1和T-2(也预先用二氧化碳清洗)中。麦芽汁在这些罐中于2℃可保存2周，提供给连续发酵生物反应罐BR-1。二周结束时，反应罐的进料换为从第二只麦芽汁贮罐(装有新鲜麦芽汁)进料。采用二只相同的麦芽汁贮罐T-1和T-2可以尽量减少更换新鲜麦芽汁时的停工时间。所有情况下，将麦芽汁加入反应罐(BR-1)前至少两天，测定麦芽汁有无污染。如污染则丢弃之，立即收集新鲜麦芽汁并消毒灭菌。
贮存期间尽量减少麦芽汁的溶氧浓度。目的是存低温不冻结麦芽汁的条件下使贮存的麦芽汁氧含量处于恒定的最低水平。要求它能防止麦芽汁与氧发生化学反应而引起不希望的老化反应(Narzib等，1993)，以便向生物反应罐持续提供麦芽汁，并最大程度降低麦芽汁在贮存期污染微生物的危险。用于贮存连续发酵用麦芽汁的大的(净)1600升圆锥形罐(T-1和T-2)原先设计用于分批发酵而非麦芽汁贮罐。因此冷却这些罐不能充分保持麦芽汁于2℃，保存三天后罐内不同区域间的麦芽汁温度变化高达15℃(表5.2)。罐中的温热区增加了微生物繁殖的风险，因此需要搅拌以保证整个罐中的均匀低温，因为这些原因，将管式喷头安装在每个麦芽汁贮罐(T-1和T-2)锥底中。进行实验以确定给罐装满麦芽汁并维持恒定低水平溶氧的最佳方案。第一次实验中，给贮罐装满收集的未加氧并经瞬间巴斯德法灭菌的麦芽汁。一旦贮罐装满1600升麦芽汁，从罐底喷入0.113立方米/小时的二氧化碳。第二次试验时，也收集未加氧并用瞬间巴斯德法灭菌的麦芽汁。这一次在装麦芽汁前用二氧化碳(0.85立方米/小时)清洗贮罐3小时，在麦芽汁输入罐中时连续喷入小量二氧化碳气(0.113立方米/小时)。这种低流速二氧化碳连续鼓泡通过罐中贮存的麦芽汁，同时向连续发酵罐提供麦芽汁。两项实验在一周贮存期内定期监测麦芽汁的溶氧浓度。
曲线图5.7显示了溶氧浓度与麦芽汁贮存时间的关系。当贮罐不用二氧化碳气预清洗时罐顶液面上空间中的空气使麦芽汁摄入了一些氧。因此不预先清洗罐，要使麦芽汁中的溶氧达到最低恒定水平要花长得多的时间。当预先清洗罐时麦芽汁溶氧浓度在整个贮存期保持恒定低水平。因此可采取预先清洗麦芽汁贮罐(T-1和T-2)并在贮存期间连续提供二氧化碳小气流通过麦芽汁以保持罐的轻微正压，作为所有连续发酵的麦芽汁贮存规程的组成部分。
还比较了用或不用0.113立方米/小时的二氧化碳喷气时贮罐中的温度变化情况，用水而不是麦芽汁进行此实验，采用连接了温度计的T型温度探头(Cole-ParmerWaterproof Thermocouple Thermometer cat.#90610-20)。收集自来水1600升到麦芽汁贮罐中，平衡三天记录贮罐不同区域的水温。用0.113立方米/小时的二氧化碳喷入罐中的水24小时，也记录水温。记录各情况的室温，贮罐内温度设置为2℃。
见表5.2，用二氧化碳喷气，贮罐内温度更均匀，测定区域温度在0.1～4.1℃之间，罐内容物不冰冻。这种较低温有助于防止贮存期麦芽汁中不希望发现的微生物繁殖。麦芽汁贮罐通过位于罐顶的无菌气体过滤器释放气体，用可调速度蠕动泵(P-1)(Masterflex_L/STMDigital Standard Drive，ColeParmer cat#07523-50)经Norprene_食品级L/S16可弯曲管将麦芽汁输入8升生物反应罐(BR-L)的入口。
5.2.2用气升通流管式生物反应罐系统连续发酵通过1/4英寸孔将麦芽汁输入反应罐BR-1的锥底部附近，通过烧结的不锈钢喷气头使用滤器(Millipore，Millex_-FG50，0.2μm滤器单元)除菌的空气和二氧化碳(99.99％纯)混合气体流入罐中。用一旋转子流量计(R-3)控制二氧化碳流速于STP，用预先校准的物质流控制器(M-1)控制空气流速于STP。发酵液作为溢流离开反应罐，流经内径1英寸的强化PVC管进入30升不锈钢收集罐(T-3)，该收集罐用外部乙二醇盘管冷却，保持4℃温度。
5.2.3产品收集产品收集罐(T-3)有一大的入口孔(1英寸内径)，此孔设计成使发酵液可顺罐壁流下尽量减少气泡产生。此罐还有一无菌的气体滤器(Millipore，Millex_-FG50，0.2μm滤器单元)供反应罐(BR-1)和该收集罐(T-3)释放气体。用位于收集罐底之上2英寸的一个1/4英寸阀门(V-12)定期排空。
5.2.4乙二醇冷却盘管将温度-23℃和压力45psig的乙二醇从伦敦酿造公司输送到小型酿酒试验工厂，通过麦芽汁贮罐(T-1和T-2)、气升生物反应罐(BR-1)和产品收集罐(T-3)的冷却夹套循环。两个麦芽汁贮罐和生物反应罐装有液相温度探头，它提供反馈给温度控制器，从而控制冷的乙二醇在罐的夹套中流动。麦芽汁贮罐贮存麦芽汁于2℃而生物反应罐内温度控制在12-22℃，取决于具体实验。产品收集罐无自动化温度控制，但可手工操作控制乙二醇流量保持罐温于4℃左右。不需要精确控制产品收集罐(T-3)的温度，因为罐中的液体只简单出空，不作分析和进一步加工。乙二醇也流经夹套并冷却来自麦芽汁罐(T-1和T-2)到生物反应罐(BR-1)的麦芽汁输送管线。一旦乙二醇经夹套循环，它回到小型酿酒试验工厂的主要管道，然后回流到伦敦工厂，一般温度为-15℃，压力40psig。
5.3生物反应罐的灭菌方案将生物反应罐BR-1装满2％(v/v)的Diversol_CX/A(Diversey Lever Canada)溶液(一种消毒洗涤剂)，并喷气体浸泡过夜。排空反应罐并用冷水冲洗。清洁液和水冲洗，循环重复二次。为准备让生物反应罐蒸气灭菌，将麦芽汁与喷气管道断开。蒸气管道连接于生物反应罐入口，然后打开以下阀门反应罐入口阀门和清洗阀门(V-6，V-7)、喷气进口阀门(V-17)、产品出口阀门(V-9，V-11)、膜取样阀门(V-8、V-10)和收集罐排出孔(V-12)。然后慢慢打开工厂的蒸气阀门，调节反应罐阀门至各个外部开口的出口处可观察到蒸气的细流。暴露于蒸气60分钟后，关闭反应罐上的所有外部阀门(V17、V8、V10、V12)，除了麦芽汁旁路阀门(V6)。关闭蒸气阀门时麦芽汁旁路阀门也关闭，此时，无菌滤器连接到收集罐以防止冷却时非无菌空气进入此系统引起污染。随着工厂蒸气管道关闭生物反应罐气体管道也在阀门V17处重新连通以维持此系统冷却时的正压。
5.4发酵系统开始工作将酿酒用麦芽汁从工厂收集到20升不锈钢压力罐中，在灭菌柜中100℃加热45分钟。将已固定的细胞无菌输入冷却的麦芽汁中(40％v/v)，将密封的罐运送到装有生物反应罐系统的小型酿酒试验工厂。该20升罐连接于装有一3/8英寸强化PVC管(Cole-Parmer，USA)的快速连接配件(Cornelius Anoka，Mn，USA)。该PVC管的另一端连于生物反应罐壁上的膜取样阀门(V-8)。除菌过滤的二氧化碳气以10psig加到20升罐，打开膜取样孔使固定化细胞混合物从该罐输入生物反应罐，不让接种物接触外部空气环境。除去20升罐的“快速连接”配件的内部成分，防止输入生物反应罐时被固定化细胞堵塞。κ-角叉菜聚糖凝胶珠的粒度累积分布(筛下的)见曲线图5.8。计算出的颗粒算术平均直径Dpam为1.252mm，Sauter平均粒径Dpsm为1.17mm。颗粒中位直径为1.255mm。实验数据和颗粒平均直径计算见附录1。
接种固定化细胞后，以分批模式操作生物反应罐直到糖和双乙酰浓度达到目标值，就比重而言低于3°P，就双乙酰而言低于100μg/L。然后准备好该系统进行连续发酵。为了用热水淋洗和用蒸气灭菌麦芽汁输送管道，打开阀门V-2(或T-2的V-4)、V-5和V-6，同时关闭V-1(或T-2的V-3)和V-7，分开麦芽汁流路。然后经V-2(或T-2的V-4)提供约80℃的水冲洗麦芽汁输送管道。热水冲洗后在同一部位连接工厂蒸气管道，蒸气灭菌麦芽汁输送管道至少30分钟。在关闭蒸气管道的同时，也关闭旁路阀门(V-6)。该系统冷却后关闭V-2(或T-2的V-4)，断开蒸气管道。打开麦芽汁罐阀门V-1(或T-2的V-3)和旁路阀门(V-6)，开启麦芽汁输送泵P-1。通过旁路阀门V-6将麦芽汁送至污水排放口，直到管道内的冷凝液被新鲜的冷麦芽汁代替。此时关闭旁路阀门并打开反应罐入口阀门V-6，开始连续发酵加工。
每两周两贮罐(T-1和T-2)交替供应麦芽汁。T-1供应麦芽汁二周后，停止连续进料泵P-1，关闭生物反应罐入口处的阀门V-5，然后将麦芽汁输送管道连接于第2贮罐T-2。如前一段所述冲洗和灭菌管道，在短暂停止不到一小时后恢复连续发酵。
表5.1 图5.6所示流程图各部件详细说明PTFE，聚四氟乙烯；SS，不锈钢
图21所用符号 可弯曲连接管和活头 气体过滤器_压力调节器 泵 阀门 图5.7在不同的装罐条件下麦芽汁贮存罐(T-1或T-2)中麦芽汁溶氧浓度和贮存时间表5.2 麦芽汁贮存罐(T-1或T-2)不喷CO2气平衡3天后，以及喷0.113立方米/小时的CO2气24小时后，罐内水温情况
图5.8含固定化酵母菌细胞的κ-角叉菜聚糖凝胶珠的累积颗粒大小分布第6章 κ-角叉菜聚糖凝胶固定的贮陈酿酒酵母菌科学家们已研究了物理性包埋完整细胞的各种基质，包括藻酸钙(Bejar等，1992；Curin等，1987；Masschlein and Ramos-Jeunehomme，1985；Nedovic等，1996；Shindo等，1994；White and Portno 1978)、琼脂糖(Hooijmans等，1990；Lundberg andKuchel 1997)和角叉菜聚糖凝胶(Norton等，1995；Wang等，1982)。角叉菜聚糖是一种食品级材料，用于细胞包埋时其优点在于其机械强度超过其它凝胶(Buyukgungor，1992)。
在本章第一部分中监测到反复分批发酵三轮后酵母菌细胞定居在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中。检查了固定化细胞和释放入液相的细胞的存活力。监测了整个反复分批发酵过程中的发酵参数，包括乙醇、麦芽糖、麦芽三糖、果糖和葡萄糖，并与在同样营养条件下只用游离悬浮的酵母菌细胞发酵的对照相比较。迄今关于长期固定化并连续接触外界应力和发酵产物后对细胞的物理影响的资料公布的很少(Virkajarviand Kronlof，1998)。本章第二部分检测了在气升式生物反应罐中延长连续发酵时间固定在角叉菜聚糖凝胶珠中的酵母细胞的存活力、细胞群分布和物理外观。还检测了长时间内反应罐中固定化和游离悬浮细胞群的呼吸缺陷型酵母菌的相对百分比。
角叉菜聚糖由重复的3-6个脱水半乳糖单元组成，各种角叉菜聚糖的区别在于重复性半乳糖单元上硫酸酯基团数目和位置的不同。角叉菜聚糖凝胶化机制的图解说明见图22。当角叉菜聚糖处于溶胶状态时，其多糖链为随机线团构型。当形成足够的螺旋而为连续网络提供交联时，发生胶凝化。由于形成更多螺旋或由于螺旋形成聚集体，凝胶会变得更牢固更有刚性(Reesl，972)。
三种常见的角叉菜聚糖类型是λ、ι和κ型。见图6.2说明，它们在硫酸酯含量上不同，硫酸酯量影响到多糖链的溶解性。λ角叉菜聚糖为高度硫酸酯化，缺乏形成凝胶的能力(Marrs，1998)。ι角叉菜聚糖在钙离子存在下形成高弹性的弱凝胶，不显示明显的脱水收缩。当凝胶进一步形成螺旋或聚集体的倾向强烈，使网络收缩而引起液体“渗出”时发生脱水收缩(Rees，1972)。κ-角叉菜聚糖中等程度硫酸酯化，存在钾离子时形成更牢固的刚性凝胶，将经历某种脱水收缩。κ-角叉菜聚糖产生强度提高的凝胶使其成为固定化整体酵母菌细胞的理想材料。
图6.2λ、ι和κ-角叉菜聚糖的化学结构角叉菜聚糖的一个重要特征是其可逆性热胶凝化性能。当角叉菜聚糖溶液冷却时粘度增加而发生胶凝化。当溶液加热时，粘度降低，角叉菜聚糖返回溶胶状态。通过控制促胶凝化阳离子溶液的组成，可改变角叉菜聚糖从溶胶转变成凝胶时的温度，κ-角叉菜聚糖胶凝化温度随溶液氯化钾浓度增加而提高。可利用此现象来设计细胞固定化的方法，因为可避免严重的温度波动(Neufeld等，1996)。可控制角叉菜聚糖胶凝化温度使其足够高而在发酵条件保持凝胶，也可足够低使酵母细胞可与溶胶状态的角叉菜聚糖混合而在珠胶凝化前对其存活力无有害作用。
已表明凝胶基质中固定化对酵母细胞代谢和生理的许多影响因素有需要进一步研究。固定化细胞经受的微环境与液相中的游离细胞不一样，因为在底物可以转运到其表面之前，另有凝胶基质和其它包埋酵母细胞产生的屏障需要克服(图23)。已对凝胶基质中的传质速度作了许多研究(Estape等，1992；Hannoun andStephanopoulos，1986；Korgel等，1992；Kurosawa等，1989；Merchant等，1987；_yaas等，1992；Venancio and Tiexiera，1997)获得了对固定化细胞进行营养限制可能对发酵性能有潜在负面作用的更好了解。小分子在角叉菜聚糖凝胶中的有效扩散系数与其在水中的扩散系数相当，此凝胶允许小分子，例如葡萄糖和乙醇进行分子扩散。然而在典型的固定化细胞发酵中，除分子扩散外营养主要通过对流快速转运给固定化细胞珠(Hannoun and Stephanopoulos，1986)。但当养料进入珠时，转运放慢因为主要靠分子扩散.这意味着凝胶珠边缘的酵母细胞可能具有优于珠中心细胞的独特营养优势。
还必须考虑固定化酵母菌的衰老，随着连续发酵进行数月并在规定的拟稳态条件下发酵，包埋的细胞发生衰老。然而，分批发酵时，酵母细胞的环境随时间而变化，细胞只重复用于有限次数的发酵，然后丢弃。需要更多工作研究连续发酵对酵母细胞存活力的长期作用，这涉及到其发酵性能。
本章A部分检查了反复分批发酵三轮中酵母菌定居在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的动力学。监测了固定化和游离悬浮的酵母的存活力和细胞浓度，以及乙醇、°P和蔗糖浓度。B部分检查了发酵时间对凝胶珠中细胞位置和分布、以及酵母细胞形态的影响。用扫描电镜(SEM)检查了四个不同时间1)生产珠后立即；2)分批发酵二天后；3)在试验规模气升式生物反应罐连续发酵二个月后；4)在试验规模气升生物反应罐连续发酵6个月后凝胶珠不同区域中的κ-角叉菜聚糖固定化酵母细胞。还测定了固定化和液相中的酵母细胞的存活力和浓度。还检测了在气升式反应罐中连续发酵5个月后呼吸缺陷型酵母菌(固定化或液相中游离的细胞)的相对百分比，并与传统分批啤酒发酵所见百分比相比较。整个研究中采用生产上的贮陈酵母菌株。
6.1实验程序κ-角叉菜聚糖凝胶珠生产κ-角叉菜聚糖凝胶X-0909是哥本哈根Pectin AS所赠送。κ-角叉菜聚糖凝胶珠含有包埋的贮陈酵母细胞，用固定混合器工艺生产，起始细胞负荷为2.6×107细胞/ml凝胶(专利申请2133789(Neufeld等)，1996)，珠径0.5-2.0mm。
发酵培养基加拿大Labatt酿酒房提供的酿酒用麦芽汁，比重17.5°P，见材料与方法中详述。
A部分κ-角叉菜聚糖凝胶珠固定化酵母菌的反复分批发酵动力学于21℃在2升锥形烧瓶中进行发酵，以150rpm振摇。固定化细胞珠的载体负荷为40％(v/v)，发酵总体积1升。每次发酵持续7天，在R1的麦芽汁中投入新鲜固定的细胞珠，发酵结束时使混合物通过无菌不锈钢筛(筛孔大小500□m)从发酵液中分离得到这些珠。将这些珠再以相同比率投入R2的新鲜灭菌麦芽汁中。然后第三次(R3)分批发酵。每次发酵头三天每天取样2次，第4、5天每天一次。一式二份或一式三份进行发酵。所有发酵与游离悬浮细胞的对照发酵在相同条件下进行，后者例外的只是游离细胞以4克/升的比率投入发酵。分析样品中游离和固定化细胞的存活力、细胞浓度、液相糖类和乙醇浓度。用公式3.20计算固定化细胞发酵三轮和游离细胞对照发酵使底物总的可发酵葡萄糖产生乙醇的产率因子(yield factor)YP/S。对于所有发酵，计算从发酵开始到麦芽糖消耗尽时的产率因子。
用公式3.25计算出R1、R2和R3和游离细胞对照从开始发酵到麦芽糖耗尽时，生物反应罐每一总工作容积每单位发酵时间产生的乙醇量，即乙醇生产率V乙醇。就效率因子和乙醇产率而言，固定化和自由悬浮酵母细胞的贡献互相并无区别。
用公式3.3和3.4计算平均的游离细胞对照的局部最大比繁生长速率和细胞倍增时间。
B部分固定化酵母菌在延长发酵时的存活力和形态特征分批发酵条件分批发酵在2升三角烧瓶中于21℃进行，振荡频率150rpm。载体负荷为40％(v/v)总发酵容积1L。
连续发酵条件连续发酵采用试验规模气升通流管式生物反应罐。所有数据得自8升工作体积反应罐，除了2个月时的扫描电镜结果得自采用相同发酵培养基和固定化方法的50升反应罐外。用空气和CO2的混合气使反应罐中的固定细胞珠(40％v/v)流化，在12、17和22℃控温发酵条件下操作生物反应罐，滞留时间0.9-1.8天。六个月实验期间气升反应罐的最高乙醇浓度达到73公斤/立方米，平均58公斤/立方米。
微生物学分析每周至少从气升生物反应罐的液相取样一次，以检查污染情况，包括野生酵母，非贮陈酵母，以及需氧和厌氧的啤酒腐败菌。5个月之后，取液相醇母菌细胞以双份检查其呼吸缺陷型变株。
扫描电镜(SEM)在以下四个不同时间1)生产固定化细胞珠后和接种到发酵培养基之前，2)分批发酵2天后，3)在试验规模气升通流管式生物反应罐中连续发酵2个月后，4)在试验规模气升通流管式生物反应罐中连续发酵6个月后，采集含固定化贮陈酵母细胞的κ-角叉菜聚糖凝胶珠(1.0-1.5mm直径)样品作SEM检查。SEM检查的方法和有关样品制备见4.7节描述。在SEM同时用4.6节所述方法评估酵母细胞(固定化和自由悬浮)的浓度和存活力。
6.2结果和讨论A部分固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中酵母菌的反复分批发酵动力学每次将固定化细胞再投入新鲜麦芽汁后发酵时间大为减少，见曲线图6.4(a)(b)(c)说明重复分批发酵三轮，麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖和乙醇与发酵时间的关系。从这些图可以看出，蔗糖完全耗尽的时间，第一轮(R1)为64小时，第二轮(R2)为44小时，第三轮(R3)为26小时。不含固定细胞珠的对照游离悬浮细胞发酵蔗糖完全耗尽花了82小时，见曲线图6.5。从曲线图6.4也可见三轮重复分批固定化细胞发酵的第三轮乙醇最终浓度最高。因为κ-角叉菜聚糖是一种水凝胶，当再投入新鲜麦芽汁时有些乙醇带在珠中。结果，与对照游离细胞发酵相比较，在R2和R3的零时间发酵液中已存在一些乙醇，而葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和果糖的初始浓度在固定化细胞发酵中较低(曲线图6.4和曲线图6.5)。计算各次发酵的产率因子可在比较的基础上确定每消耗1克蔗糖产生几克乙醇的产量。
曲线图6.4(a)利用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞反复分批发酵第一轮(R1)中的麦芽糖，麦芽三糖、葡萄糖、果糖和乙醇浓度与发酵时间的关系。
曲线图6.4(b)利用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞反复分批发酵第二轮(R2)中的麦芽糖，麦芽三糖、葡萄糖、果糖和乙醇浓度与发酵时间的关系。
曲线图6.4(c)利用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞反复分批发酵第三轮(R3)中的麦芽糖，麦芽三糖、葡萄糖、果糖和乙醇浓度与发酵时间的关系。
曲线图6.5对照自由悬浮的贮陈酵母菌发酵(无固定化细胞)的麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖和乙醇浓度与发酵时间的关系。
曲线图6.6(a)和(b)比较了R1、R2和R3时麦芽糖和乙醇浓度分别与发酵时间的关系。在反复的R1中，酵母细胞总是在投入新鲜麦芽汁后立即摄取麦芽糖。乙醇浓度在R1时较早达到高峰，也比头两批发酵达到较高浓度。如曲线图6.6(b)所示，R1时的乙醇产量最初滞后，滞后当这些固定化细胞再投入R2时急剧减少，再投入R3时进一步减少。
曲线图6.6(a)采用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞重复分批发酵R1、R2和R3的麦芽糖浓度和发酵时间的关系。
曲线图6.6(b)采用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞重复分批发酵R1、R2和R3的乙醇浓度和发酵时间的关系。
曲线图6.7(a)显示R1、R2和R3时生物反应罐每单位总容积的固定化细胞浓度与发酵时间的关系。图6.7(b)显示这些发酵中从固定化细胞基质上释放的游离细胞进入液相与发酵时间的关系。图6.7(c)显示三批发酵中反应罐每单位总容积中的固定化和游离的酵母细胞总数。图6.7(a)显示R1时κ-角叉菜聚糖凝胶中固定化细胞在最初接种入麦芽汁后细胞浓度不断增加。当胶珠再投入重复的R2的新鲜麦芽汁时细胞继续在胶珠中繁殖。第三次，包埋的细胞再投入新鲜麦芽汁时，固定化细胞浓度增加速度减慢。R1发酵时从κ-角叉菜聚糖凝胶基质中释放进入液相的游离细胞、固定化细胞和总细胞的浓度变化情况见曲线图6.8。
曲线图6.7(a)R1、R2和R3发酵时反应罐每单位总容积的固定化贮陈酵母细胞平均浓度与发酵时间的关系。误差杆代表实验数据上下限(n＝2)。
曲线图6.7(b)R1、R2和R3发酵时反应罐每单位总容积的释放入液相的贮陈酵母细胞浓度与发酵时间的关系。误差杆代表实验数据上下限(n＝2)。
曲线图6.7(c)R1、R2和R3发酵时反应罐每单位总容积的总(固定化和液相中的)贮陈酵母细胞浓度与发酵时间的关系。误差杆代表实验数据上下限(n＝2)。
曲线图6.8用固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的贮陈酵母细胞三次重复分批发酵第一次R1的固定化的，液相和总(固定化加液相)细胞浓度对发酵时间的变化图。
R1时κ-角叉菜聚糖凝胶珠中固定化细胞的浓度增加，速度类似于只含液相细胞的对照发酵。通过比较图6.9对照游离细胞发酵的平均增殖曲线与曲线图6.10固定在角叉菜聚糖中细胞的类似增殖曲线而得以证实。R1期间凝胶珠尚未完全被酵母菌定居，凝胶基质看来对珠内生长的酵母细胞无抑制作用。到R2时，基质看来限制了珠内细胞的增殖，如此轮发酵期间细胞数增加较少所显示的那样。这可能是由于凝胶的性质，或珠中酵母细胞拥挤，或细胞缺乏营养供给所致。
曲线图6.9生物反应罐每单位总容积自由悬浮贮陈酵母菌对照发酵的平均细胞浓度(n＝3)和发酵时间的关系。这些发酵期间无固定化细胞。
曲线图6.10 R1、R2和R3发酵时每毫升凝胶的固定化贮陈酵母菌浓度和发酵时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限(n＝2)。
表6.1中显示了三批发酵和对照时可发酵糖底物转变成乙醇的产量YP/S。表6.2中还给出了用表6.1数据计算出的生物反应罐乙醇容积产率。糖发酵产生的乙醇产量彼此或与对照无显著差异。产量均高于Guy-Lussae公式预测的理论产量0.51的90％。如先前所述，生物量产生和酵母细胞形成的其它副产物阻止了其效率达到理论值的95％以上(Hardwick，1995)。三批重复分批发酵中生物反应罐的乙醇容积产率批与批之间显著不同。随着每加一轮重复分批发酵，乙醇产率提高，到R3时固定化细胞比对照发酵更多产。R2时产生的乙醇总量不明显高于R1时产生的，但发酵时间不到R1和对照发酵的一半。有许多因素可能对每批重复发酵固定化细胞的发酵速度提高有贡献，如酵母细胞适应了发酵条件和细胞浓度逐渐提高，到R3时反应罐每单位容积的总细胞数大大高于对照。曲线图6.7(b)中，液相中游离悬浮细胞(从凝胶基质中释放的)浓度与发酵时间的关系，证明从凝胶珠中释放的细胞数随每批发酵而增加。当凝胶珠完全装满酵母细胞时，看来会释放更多的细胞到液相中。Husken等(1996)进行了一些研究检测了细菌细胞集落的扩张和从κ-角叉菜聚糖凝胶厚片中发出/释放。Vives等(1993)报道他们在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中达到的酵母细胞最高浓度为每克凝胶109个细胞，这是R2时凝胶颗粒中达到的浓度。在B部分连续发酵期间见到了类似的最高细胞浓度。然而，凝胶基质中最高细胞负荷量取决于初始细胞负荷量、凝胶的组成和其它因素。
表6.1 R1、R2、R3和自由悬浮细胞对照发酵中从底物葡萄糖(Glc)、果糖(Frc)、麦芽糖(Mal)和麦芽三糖(DP3)产生的产物P乙醇产量YP/S
*符号tf是麦芽糖被完全摄取的时间(小时)，下标f指所述分析物在t＝tf时的浓度表6.2 与游离悬浮细胞分批发酵相比较，生物反应罐固定化细胞分批发酵(R1、R2和R3)的乙醇产率[V乙醇＝产生的乙醇公斤数/每小时，每立方米反应罐容积]
*当麦芽汁完全被摄取时的计算值影响到每批重复分批发酵所见的反应罐单位容积产率增加的另一因素涉及酵母菌细胞的适应性。到第一批发酵结束时，酵母细胞的代谢机制已适应了发酵所述发酵条件，这可导致以后分批发酵开始时滞后期的缩短，提高发酵速度。在此研究中所有的对照发酵用新鲜制备的贮陈酵母菌。令人感兴趣的是再投入新鲜游离悬浮的对照酵母菌和再投入固定化细胞一起来进一步检测其相对对细胞浓度作用的影响。
图6.11表明用亚甲蓝法作指示剂当固定化细胞最初投入R1的麦芽汁中时其存活力低(＜50％)，但发酵48小时后，固定化细胞存活力超过90％。R3期间酵母细胞快速定居在珠中其存活力仍高。然后到R3发酵结束时存活力略微减低，然而，三次重复分批发酵期间，释放入液体培养基中的游离细胞存活力比其固定化细胞高。固定化基质可能对酵母细胞存活力(传质限制和/或空间限制)有负面影响。或者活的酵母细胞可能比非活细胞优先从固定化基质中释放入液体培养基中。
采用附录1中三次独立的游离悬浮酵母菌对照发酵所得的平均数据得出了ln(X/Xo)与发酵时间的关系图，见曲线图6.12。其斜率等于在21℃以150rpm振荡，细胞在酿酒麦芽汁中达到局部最高比增值率。该酵母菌的局部最高比增殖率为0.096/小时，细胞倍增时间为7.22小时。此项工作中求出的□max定义为局部□max，因为如理论章节所述只有当S显著大于Monod常数Ks时，才能达到Monod公式中用的真实□max。需要作更多工作来评价这些发酵中限制性底物的Monod常数Ks，以证实如Monod公式确定的那样，计算的局部□max是真正最高的。
图6.11R1、R2和R3发酵中的固定化贮陈酵母细胞存活力(亚甲蓝染色法)与发酵时间的关系。
图6.12平均的游离悬浮酵母菌对照发酵的指数增殖期中Ln(X/Xo)与分批发酵时间的关系，其中X是t时的细胞浓度。Xo是t＝0时的细胞浓度(n＝3)。
B部分延长发酵时间时固定化酵母菌的存活力和形态学特征。凝胶珠接触发酵培养液之前和用固定混合器加工生产固定化细胞珠之后，凝胶珠的细胞浓度为2.6×107细胞/ml(表6.3中的值是两个样品的平均值)。SEM摄影显示单个细胞均匀地分布在整个凝胶珠中(图24)。
表6.3 整个发酵期中游离悬浮和包埋在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的固定化贮陈酵母细胞的存活力(亚甲蓝法)和浓度
*根据一个样品分批发酵二天后存活力＞90％，凝胶珠中细胞浓度增加10倍(表6.3)。细胞(＞90％是活的)还开始从凝胶中释放入发酵的液相中，产生每毫升液体107细胞浓度。凝胶珠中形成了小的酵母菌落，单个细胞上有许多芽痕，见图25。
在气升式生物反应罐中连续发酵2个月后固定化酵母细胞存活力下降(表6.3)，但液相中细胞保持高活力(＞90％)，在试验规模气升式生物反应罐中的几次不同连续发酵支持这一发现。图26的SEM显示在珠周边形成了二个月大的酵母菌菌落证实了其他学者的结果(Bancel and Hu，1996，Godia等，1987；Wada等，1979，Wang等，1982)。用SEM摄影给几份样品作了固定化细胞珠外缘酵母菌形态和凝胶珠中心酵母菌形态的比较，位于珠周边的细胞呈卵形、光滑、有许多芽痕(图27)，表明酵母菌在增殖(Smart，1995)。珠中心的细胞照片(图28)看来发生了变形，很少有芽痕形成，缺乏芽痕可能表明珠中心处营养如氧供应有限。图28中酵母菌表面不规则也可能表明细胞衰老(Barker and Smart，1996；Smart，1999)。
在气升式生物反应罐连续发酵6个月后，角叉菜聚糖凝胶中固定化的酵母菌存活力降到50％以下(表6.3)。应注意虽然6个月时收集的固定化细胞浓度和存活力只有一个数据点，但五个月的数据相类似，固定细胞浓度为每毫升凝胶1.14×109个细胞，存活力＜50％。虽然看见固定化细胞存活力随时间逐步降低，但液相中的细胞存活力确实仍高。此外，即使珠中固定化细胞存活力总的讲较低，但在第6个月连续发酵中反应罐仍生产出了发酵完全的啤酒。这些发现的可能原因包括活力高的游离悬浮酵母细胞对发酵的明显贡献。还有位于珠周边的活力高的固定化细胞与珠中心细胞相比传质屏障较少，也可能有贡献。尚不清楚固定化细胞是否能在凝胶基质中重新分布或这些细胞仍留在其首次定居的地方。连续发酵6个月后这些珠内的细胞浓度达到最大的109细胞/毫升凝胶珠。
图29是用SEM拍摄的整个珠的图象。检查的许多珠几乎一半是空心的。空心腔可能是角叉菜聚糖凝胶结构降解的结果，以及SEM制备方法可能进一步促进其降解。在新鲜的珠制品中没观察到这种空穴。其他人(Bancel等，1996)的先前工作显示增殖细胞可导致凝胶网络疲软。Audet等(1988)报道将洋槐豆胶加入κ-角叉菜聚糖，改进了固定细菌的凝胶珠的机械强度。
在整个6个月啤酒发酵实验期间，至少每周一次测试气升反应罐的污染情况。没有在实验的任何时间测到细菌污染。最后两个月，测得的污染酵母菌浓度波动于1-5cfu/ml。此酵母菌能在37℃于PYN培养基中生长，不在DUBA培养基(有细菌选择性)上需氧和厌氧生长，不发酵糊精，在CuSO4培养基(有野生酵母菌选择性)上不生长。
五个月后呼吸缺陷型酵母细胞平均百分比为7％，高于在产业化分批发酵中用此菌株时正常所见的平均值2％。其它学者报道了类似发现(Norton and D′A more，1995)。突变产生的呼吸缺陷型酵母菌不能降解葡萄糖成为CO2和水。这些酵母菌线粒体的活性有永久性损伤，通常是由于线粒体DNA突变所致(Hardwick，1995)。SEM样品制备引起的人为假象可能引起混淆。已采用核磁共振(NMR)光谱分析(Fernandez，1996)和共聚焦显微镜(Bancel and Hu，1996)等技术来非侵入性也检测固定化细胞。NMR摄影技术使研究者们能够研究生物膜中细胞和生物化学物质的转运、流动和空间分布。一些学者(Bancel and Hu，1996)也证明可采用共聚焦激光扫描显微镜，通过一系列光学切片来观察多孔明胶微载体中固定的细胞。
虽然在酿酒业中采用亚甲蓝法作为细胞存存活力的标准指示剂，但此法有许多缺点(Mochaba等，1998)。亚甲蓝法测定酵母菌群是活或是不活的依据是活细胞氧化此染料成为无色形式的能力。非活细胞缺乏氧化此染料的能力因而着色(O’Connor-Cox等，1997)。平板计数和玻片培养技术依据细胞在琼脂平板上生长产生大菌落，或在显微镜载玻片上复盖的培养基上产生微菌落的能力(ASBC技术委员会和编辑委员会，1992)。在Labatt中正在进行检测经长时间后固定化基质中酵母菌存活力的工作，不仅采用亚甲蓝，而且采用上述方法以及用活性染色进行共聚焦显微镜技术。除了测定细胞的存活力，进一步工作也必须着重于固定化细胞的存活力。当用存活力说明细胞生长和复制能力时，活力也检测了酵母菌的发酵性能、活性或酵母菌从应力下恢复的能力(Smart等，1999)。
第七章 气升式连续啤酒发酵系统中的香味产物7.1发酵程序采用固定化细胞连续发酵生产啤酒与其它应用大不相同，因为所得产物不止用一种感兴趣的成分如乙醇来衡量，而是许多化学成分的平衡，它们必须平衡才能生产出合格啤酒。检验了在连续初发酵和然后的分批保温期间氧对酵母菌香味物质代谢的作用。还检测了两种水平的滞留时间对香味物质代谢的影响。最后，将商品化α-乙酰乳酸脱羧酶制剂加入到连续发酵麦芽汁中，监测液相总双乙酰浓度。
7.1.1在连续初发酵期生物反应罐流化气体中空气的相对含量对酵母菌代谢的影响。
改变生物反应罐流体气体中的空气含量，因而改变了氧含量，同时保持滞留时间、温度和所有其它可控制的过程变量恒定。保持气体总体积流速恒定于472ml/分(STP)，温度15℃。整个试验中采用含固定化LCC3021酵母菌的κ-角叉菜聚糖凝胶珠，起始细胞负荷为每毫升凝胶1×108个细胞。试验中采用了四种空气体积流速(表7.1)，生物反应罐平均滞留时间Rt为1.18天。
表7.1 连续发酵期内通过喷头向生物反应罐提供的空气的体积流速。总体积流速472ml/分钟STP。气体中其余部分为CO2。
实验期间反复进行以下分析氨基氮(PAN)、总可发酵糖类(作为葡萄糖)、乙醇、总双乙酰、啤酒挥发物(选出的酯和醇)和液相中酵母细胞浓度和存活力。还至少每周一次测定反应罐的污染情况。当推测每种空气体积流速连续发酵时处于拟稳态(至少三次反应罐周转时间)时测定生物反应罐液相中的溶氧浓度。
7.1.2发酵后分批保温期接触氧对酵母菌代谢的影响即使生物反应罐流化气体的氧含量较低(34毫升/分钟STP)，7.1.2节的实验期间乙醛和总双乙酰浓度之高也是北美贮陈啤酒市场不能接受的。因此采用了一种新方法，在略高的21℃温度下分批保温连续初发酵液48小时，以降低这两种化合物的浓度。另外前节7.1.2的结果表明流化气体中的空气含量对所测香味化合物有明显影响。因此检测了初发酵下游工艺(进行次级分批保温)的需氧和厌氧条件对酵母菌香料代谢的影响。此试验中采用LCC3021酵母菌株的高絮凝变体在50升气升式反应罐中进行了连续初发酵，因为此研究所需的样品体积对8升反应罐容量而言太大。操作条件为流化气体中CO21180ml/分钟，空气189ml/分钟STP、反应罐平均滞留时间Rt为1.0天，温度15℃，高比重17.5°P的贮陈酿酒用麦芽汁。总共采取4份样品(100ml咬边的管瓶)、两份在厌氧条件下操作，另两份接触需氧环境。
厌氧取样程序如下将两个10ml和6个25ml咬边管瓶高压灭菌，然后放在厌氧盒(Labmaster100，mbraun，USA)中。此盒用氩气作为清洗气体。让100ml管瓶平衡45分钟，然后用铝盖和Teflon_隔膜密封。用70％(v/v)乙醇液消毒装有3英寸16号针头的50ml注射器，通过戳破取样阀门的隔膜从反应罐中取样，并将样品注入100ml预先清洗过的厌氧管瓶中。必须通过另一无菌注射器针头提供该咬边管瓶的一个出口，以释放装入样品液时管瓶中的压力。需氧样品不用注射器和针头而通过完全打开膜取样阀，从反应罐中抽取到未密封的100ml样品瓶中，接触大气。
室温静置液体样品2小时，让酵母菌沉降，液体中剩下的细胞浓度约106细胞/ml。一旦沉降，将每一100ml管瓶中的液体倾倒入3个25ml管瓶中。在厌氧盒中处理厌氧样品，以尽量降低氧摄取，而需氧样品在层流爱风橱内处理。将每份100ml管瓶中的样品分装于3个较小的25ml管瓶中，以便不会因取样改变发酵过程而能对样品进行分析。当将需氧样品转移到较小的管瓶中时，不加盖在21℃进行培养。将厌氧样品转移到3个较小的管瓶中，用铝盖和Teflon_隔膜密封。为避免管瓶中因放出CO2而产生压力，同时预防样品与外部需氧环境接触，用针头穿刺此隔膜。将针头接触外环境的一端浸没在乙醇中(压头不到1厘米)，防止空气返流入样品中。在2、24和48小时收集分析用样品。也直接从反应罐中取样并立即分析，以评估发酵时反应罐中的发酵状态。分析样品中总的可发酵糖类(作为葡萄糖)、乙醇、总双乙酰和啤酒挥发物(选出的酯和醇)。
7.1.3连续啤酒初发酵时液体滞留时间对酵母菌代谢物的影响为了检测液体滞留时间对酵母菌代谢活性的影响，进行了实验，包括改变用固定化于κ-角叉菜聚糖凝胶珠中LCC3021酵母细胞进行连续啤酒初发酵时反应罐的麦芽汁体积流速。整个试验中反应罐的温度保持17℃恒定，供给反应罐的气体体积流速也保持恒定于472ml/分钟STP。气体是空气(11ml/分钟STP)和CO2(461ml/分钟STP)的混合气。κ-角叉菜聚糖凝胶中酵母细胞的起始浓度为2.6×107细胞/毫升凝胶珠，生物反应罐含有40％(v/v)的珠。整个试验期间反复进行以下分析糖类、游离氨基氮(FAN)、总可发酵糖类(作为葡萄糖)、乙醇、总双乙酰、啤酒挥发物(选出的酯和醇)，液相酵母细胞浓度和存活力。至少每周一次测定反应罐的污染情况。
7.1.4采用商品化α-乙酰乳酸脱羧酶来降低连续啤酒初发酵中的总双乙酰大多数北美酿酒商认为双乙酰高浓度是他们的啤酒中一种不良性口味缺陷。迄今进行的连续初发酵中总双乙酰浓度一直高于北美贮陈啤酒传统分批发酵的阈值(70-150□g/L)。分批发酵时双乙酰降低发生在发酵后期不再存在氧且不输入其它糖时。在连续发酵系统中，通过喷头供给反应罐的氧保持低水平，而连续供给反应罐新鲜麦芽汁。因此探索了采用商品化酶制品控制连续反应罐中双乙酰浓度的新策略。
麦芽汁发酵时，一种缬氨酸合成的中间产物，α-乙酰乳酸，在酵母细胞外被氧化脱羧而形成了双乙酰。酵母细胞然后重新吸收双乙酰并将其转变成香味较差的3-羟基丁酮。在麦芽汁分批发酵时，α-乙酰乳酸氧化脱羧基形成双乙酰是限速步骤。连续发酵期间，生物反应罐产生的高总双乙酰浓度是不可接受的(300-400□g/L)。Novo-Nordisk A/S的商品酶α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)可将α-乙酰乳酸直接转变为3-羟基丁酮，从而避免产生不想要的双乙酰中间产物(曲线图7.1)(Jepsen，1993)。
曲线图7.1α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的作用将α-乙酰乳酸脱羧酶加入输入生物反应罐的麦芽汁中，检测它对总双乙酰浓度的净作用。降低双乙酰的其它方法包括发酵后分批保温48小时和固定化次级发酵系统(这是α-Laval的技术(Anon，1997))也作了探索。其他这两种策略能成功地降低发酵后双乙酰的水平，但均不能从源头上(即反应罐出口处)影响双乙酰水平。通过在麦芽汁中加入ALDC降低了反应罐排出液的双乙酰浓度，可最大程度地减少或消除这一发酵后处理期。
在10℃的贮陈麦芽汁中于pH6.0时ALDC有最佳活性。而产业化麦芽汁通常为pH5.0，此时，ALDC在35℃时活性最高(Anon，1994)。在啤酒发酵典型的较低温度和pH条件下，ALDC活性不是最佳。1997年加拿大卫生部修改了加拿大食品和药物规程(SOR/97-81)允许在酒精饮料中使用ALDC从而为其在加拿大酿酒业中应用打开了大门。携带有编码来自短芽孢杆菌的ALDC(E.C.4.1.1.5)基因的枯草芽孢杆菌可产生ALDC酶。因为ALDC是由经遗传修饰的微生物(GMO)产生的一种酶，在商业产品中使用此酶之前应让公众知晓。这些实验用贮陈酵母菌LCC3021。高比重17.5°P的贮陈酿酒麦芽汁由伦敦Labatt酿酒房提供。监测乙醇、总可发酵糖类(作为葡萄糖)、总双乙酰和液相中细胞浓度。如第4章所述酵母细胞固定在κ-角叉菜聚糖凝胶珠中。在推测达到拟稳态前生物反应罐得以三次转换。如前所述本工作所用的双乙酰方法称为“总双酰”，因为该方法测定的是双乙酰及其前体α-乙酰乳酸的量。这次实验时观察到总双乙酰降低是由于酶将α-乙酰乳酸直接转变成3-羟基丁酮和其后其衍生物双乙酰浓度降低的联合作用。
用于实验的α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)系Novo Nordisk A/S，丹麦Maturex_L赠送。此酶活性为1500ADU/g，ADU是在标准条件下引起α-乙酰乳酸脱羧每分钟产生1微摩尔3-羟基丁酮的酶量，见Novo Nordisk Method AF27中所述(Anon，1994)。
连续发酵条件在8升气升管式生物反应罐中投入40％(v/v)含有固定化贮陈酵母细胞的κ-角叉菜聚糖凝胶珠进行连续发酵。用CO2(438ml/分钟STP)和空气(34ml/分钟STP)的混合气喷入反应罐。试验期间发酵温度控制在15℃。反应罐滞留时间Rt为1.5天，监测这些条件下的总双乙酰浓度，达到控制双乙酰浓度的平均拟稳态。然后将ALDC以72□g/L浓度(108ADU/升)加入麦芽汁监测反应罐中总双乙酰浓度的变化。
实验1，将发酵房的麦芽汁收集到20升不锈钢罐中，高压灭菌加热100℃45分钟，进料反应罐时将麦芽汁保存在2℃控温水浴中。一旦反应罐中达到了拟稳态总双乙酰浓度，向20升罐的麦芽汁中加入72□g/L(108ADU/升)的ALDC，最初κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的生物量负荷为每毫升凝胶3×107细胞。
实验2，为了最大程度减少污染，如第4章所述将此系统出口处制成密封和其它更高级密封。如实验1那样，将发酵房的麦芽汁收集到20升不锈钢罐中，高压灭菌100℃45分钟。进料反应罐时将麦芽汁保存在2℃控温水浴中。最初κ-角叉菜聚糖凝胶珠中的生物负荷量为每毫升凝胶3×107细胞。一旦反应罐中达到了拟稳态总双乙酰浓度，向20升罐的麦芽汁中加入72□g/L(108ADU/升)的ALDC。
实验3，将未加氧的17.5°P酿酒麦芽汁(1400升)收集在试验工厂的大麦芽汁贮存罐(T-1)中，经瞬间巴斯德法灭菌，用CO2喷气贮存以维持恒定的溶氧浓度＜0.10mg/L，见第5章所述。从此罐将麦芽汁输入生物反应罐直至达到拟稳态总双乙酰浓度。然后在试验剩余时间无菌加入ALDC(72□g/L)到麦芽汁中。测定贮存罐中剩余麦芽汁的量，计算使酶浓度达到72微克/升(108ADU/升)所需的酶量，然后加入ALDC。将适合的酶量溶于10升灭菌麦芽汁中，转移到20升不锈钢压力罐中，通过无菌管道将取样口与麦芽汁贮罐(T-1)连接。用无菌CO2气将ALDC溶液推压入麦芽汁贮罐中，为了确保ALDC液与贮罐中麦芽汁充分混合，喷入罐内的CO2流速增加至4720ml/分钟STP共1小时，然后返回其正常流速。贮罐保持足够的含ALDC麦芽汁至完成实验。κ-角叉菜聚糖凝胶珠中最初生物量负荷为每毫升凝胶108细胞。
7.2结果与讨论7.2.1连续初发酵时生物反应罐流化气体中空气相对量对酵母菌代谢物的影响曲线图7.2-7.11是液相中酵母菌存活力和细胞浓度、游离氨基氮(FAN)、总可发酵糖类(作为葡萄糖)、乙醇、总双乙酰、乙醛、乙酸乙酯、1-丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯浓度对连续发酵时间作图。整个方案中所有生物反应罐操作条件保持恒定除了反应罐喷气中的空气百分比直接按图中所示外。表7.2小结了拟稳态时(最少三次反应罐转换片)各分析物的平均值。
表7.2.在滞留时间，Rt为1,18天时通过喷气头进入反应罐的空气体积流速对液相酵母菌和生物反详罐中酵母菌重要代谢物的浓度的影响，为拟稳态值。
*各操作条件最后4天的平均值曲线图7.2和7.3显示在此实验中液相中的酵母菌群没有达到零。此工作研究的香味化合物由游离和固定的酵母菌共同产生，不能确定各来源的相对贡献。此工作的游离悬浮酵母菌细胞有一个以上的来源生物量增殖和从凝胶珠释放到液体培养基中的细胞。用细胞释放和增殖的复合模型研究显示，当细胞从生物膜中释放时即使反应罐以高稀释率操作，仍有细胞群液体释放到液体中(Karamanev，1991)。
曲线图7.2液相中酵母菌细胞浓度和相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟STP。
曲线图7.3液相中酵母菌存活力和相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟STP。
曲线图7.4跟踪液相中游离氨基氮(FAN)的浓度。令人感兴趣的是注意到在34ml/分钟STP空气时发生最小FAN浓度。这与最大乙醇浓度或最小总可发酵糖(作为葡萄糖)浓度不重叠。当喷气中的空气体积流速从94增加到354ml/分钟时，反应罐液相中的乙醇浓度降低同时总可发酵糖(作为葡萄糖)增加，见曲线图7.5。这可能表明与发酵相反，由于可得到的氧增加，发生更多细胞呼吸。当体积流速从STP354ml/分钟降至34ml/分钟时，乙醇浓度再次升高，然而不能达到STP流速94ml/分钟时的浓度。难以比较STP34ml/分钟与STP94ml/分钟时乙醇的精确浓度，因为还有细胞衰老、STP354ml/分钟时连续接触较高含量的氧的影响、固定化细胞群的变化所致其它因素对此系统的影响。曲线图2.4中White和Portno(1978)提到他们的塔式发酵罐中不同连续发酵时间酵母菌香味物代谢物浓度的变化.
曲线图7.4麦芽汁中游离氨基氮浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气体积STP流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟STP。
曲线图7.5液相中乙醇和总可发酵糖类(作为葡萄糖)浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟。
曲线图7.6中可见氧对总双乙酰的产生的显著影响。因为一般认为双乙酰是啤酒中不希望的香味化合物，优化生物反应罐中的氧含量的一个主要理由是控制此香味化合物的水平。以354ml/分钟喷空气后，流速降至STP34ml/分钟，总双乙酰降低。分批发酵时已知氧增加可导致α-乙酰乳酸这一双乙酰的前体形成增加(Kunze，1996)。
曲线图7.7表明喷气中空气含量与乙醛浓度之间的明确关系。随着喷气中空气百分比的增加，乙醛量也增加。乙醛赋予啤酒绿苹果味，商品啤酒中通常存在的量不到20mg/升。
曲线图7.6液相中总双乙酰浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟。
曲线图7.7液相中乙醛浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟。
表7.2和曲线图7.8-7.9显示乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯拟稳态浓度与连续发酵时间的关系。对于所有测定的酯，通气速度从94变到354ml/分钟STP导致其浓度降低。当通气速度从354降到34ml/分钟STP，乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯浓度升高，然而并不升高至94ml/分钟通气速度时所见的水平。这些化合物的反应模式彼此密切相符，己酸乙酯和辛酸乙酯显示的相对波动比乙酸异戊酯更大。当空气体积流速降至34ml/分钟STP时乙酸乙酯浓度实际进一步下降。对于此研究测定的所有酯，当流化气体中的空气完全消除时，浓度显示升高。随着反应罐中液相细胞浓度迅速降低，各酯浓度升高然后降低。
曲线图7.8乙酸乙酯浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟。
曲线图7.9液相中乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟。
曲线图7.10和7.11给出了高级醇异戊醇、异丁醇和1-丙醇对连续发酵时间的关系，对于所有测定的醇，其浓度增加是由于通气从STP 94ml/分钟增加到354ml/分钟。当通气速度改变时异丁醇显示最大的相对波动。1-丙醇浓度低于600-800mg/升的香味阈值，然而连续发酵实验中其浓度高于通常商品化分批生产的啤酒，后者通常低于16mg/升。这与处于正常范围的的异戊醇和异丁醇不同。认为化合物1-丙醇升高系丙酸还原所致(Gee and Ramirez，1994)。其他人(Hough等，1982；Yamauchi等，1995)也将1-丙醇的形成归于氨基酸氨基丁酸和苏氨酸与分别为氧代丁酸和丙醛的相应氧代酸和醛代谢所致。
曲线图7.10液相中异戊醇和异丁醇浓度与相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟STP。
曲线图7.11液相中1-丙醇浓度对相对连续发酵时间的关系。此图表明通过喷气向生物反应罐提供的空气STP体积流速。其余的气体是CO2。实验期间气体总体积流速恒定在472ml/分钟STP。
因为不希望啤酒中双乙酰、乙醛和杂醇过量，控制氧以限制它们的产生很重要。如文献综述所讨论，当酵母菌细胞的氧供增加时，合成代谢形成的氨基酸前体增加因而高级醇、氧代酸和双乙酰过剩。因为乙酰转移酶催化酯形成，已知随着可利用氧的增加，酯浓度降低。乙酰转移酶受不饱和脂肪酸和麦角固醇(它们会在存在氧时增加)的抑制(Norton and D’Amore，1994)。
对于此实验用的生物反应罐条件，测定的反应罐液相中拟稳态(最少三次反应罐周转)溶氧浓度接近于零(不到0.03mg/升)。
此实验没直接比较流化气体中空气STP 94ml/分钟和34ml/分钟的数据，因为最高空气流速(354ml/分钟)将它们分开。这是由于酵母菌暴露于先前的反应罐条件后的生理状态，固定化基质和连续发酵时间可能也引起香味产生的其它改变。
实验期间生物反应罐中任何位置均未测出污染。为了平衡酵母菌对氧的需求以维持酵母菌存活力及要求最大程度减少氧以获得具有理想香味的啤酒，可探索其它方法，如加入锌、镁等营养物，或提供酵母细胞维持存活力所需的其它外源化合物。这些加入物可进一步减少酵母菌对氧的需求。另一种可能是大部分时间以非常低的氧浓度操作，定时给予酵母菌脉冲氧维持细胞存活力。
7.2.2发酵后分批保温期接触氧对酵母菌代谢的作用因为初发酵结束时总双乙酰不在商品化啤酒的正常范围内，采取几种方法来降低这种化合物的浓度至可接受水平。一种方法是连续初发酵后立刻采用保温储存。曲线图7.12-7.21显示液相总可发酵糖类(作为葡萄糖)、乙醇、总双乙酰、乙醛、乙酸乙酯、1-丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇和己酸乙酯浓度对发酵后保温时间的关系图。如各图所示，将收集的拟稳态连续初发酵样品存放在需氧或厌氧条件下。
曲线图7.12显示需氧和厌氧样品中总可发酵糖类(作为葡萄糖)在前二小时迅速下降，在其余保温期下降较慢。此现象可能的原因是前二小时内倾出前有较多的酵母菌以及保温期开始时糖浓度较高。需氧和厌氧样品之间可发酵葡萄糖的摄取无明显差异，虽然注意到最初有某些差异。
曲线图7.13中保温开始时乙醇浓度迅速上升，然后厌氧和需氧样品的乙醇浓度以几乎平行方式随时间增加。厌氧样品乙醇的最初浓度增加与大部分糖摄取的时间相重叠。保温期末厌氧处理的样品中乙醇浓度较高。
曲线图7.12气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均可发酵葡萄糖浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)
曲线图7.13气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均乙醇浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)曲线图7.14需氧样品在生物反应罐外暴露于需氧条件后乙醛早期增加，需氧条件与糖消耗和乙醇产生的联合作用可解释此结果。至48小时保温期末厌氧样品中乙醛浓度从17mg/升下降至9mg/升，使其液体浓度降至北美贮陈啤酒的质量规格10mg/升之内。
曲线图7.15给出了总双乙酰浓度与保温时间的关系。结果显示保温期从此系统消除氧提供了降低双乙酰更有利的条件。总双乙酰曲线的形状可能与游离氨基氮消耗和随后细胞内产生缬氨酸有关，双乙酰是它的副产品(Nakatani等，1984a；Nakatani等，1984b)。连续初发酵末急双乙酰浓度为326μg/升，厌氧保温期末为33μg/升，低于商品啤酒的口味阈值。
曲线图7.14气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均乙醛浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2) 曲线图7.15气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均总双乙酰浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)曲线图7.16-7.18显示乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯的浓度与发酵后保温时间的关系。所有酯观察到的模式，需氧和厌氧样品相同。需氧和厌氧样品之间酯浓度没有不同直到保温后期，此时需氧样品的酯浓度下降而厌氧样品的上升。因为与商品啤酒的酯浓度相比连续发酵的酯浓度稍低，因此需要选择有利于酯产生的条件。
曲线图7.16气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均乙酸乙酯浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2) 曲线图7.17气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均乙酸异戊酯浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)
曲线图7.18气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均己酸乙酯浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)曲线图7.19-7.21显示异戊醇、1-丙醇和异丁醇浓度与发酵后保温时间的关系。48小时保温期末需氧和厌氧处理之间这些醇未见明显差异。然而24小时的样品显示需氧处理的所有场合浓度较高。
曲线图7.19气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均异戊醇浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)
曲线图7.20气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均1-丙醇浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2) 曲线图7.21气升生物反应罐连续初发酵后需氧和厌氧处理样品的平均异丁醇浓度与发酵后保温时间的关系。误差杆代表实验数据的上下限。(n＝2)图7.22是用于48小时需氧和厌氧保温期后一些香味化合物与商品啤酒比较的放射图。放射图是酿酒产业常用来将各种不同啤酒的特性放在一张图中进行考察和比较(Sharpe，1988)。从此图可见厌氧保温的连续发酵啤酒最接近与普通销售啤酒相配。从附录6可见除1-丙醇显著高于分批发酵啤酒外，厌氧啤酒都在销售啤酒的正常范围内。此工作中所有连续发酵产品都观察到1-丙醇较高。
连续初发酵期形成1-丙醇并且保温期不显著降低，不论采取需氧或厌氧条件。
Kunze(1996)说以下因素将增加分批发酵时高级醇如1-丙醇混合，麦芽汁强力通气和反复加入新鲜麦芽汁给已有的酵母菌。最终，理想的情况是通过优化初发酵反应罐中的条件而完全取消后来的保温期。然而可通过优化保温温度(酵母菌去除双乙酰非常依赖于温度)、保温期开始时残留在液体中的可发酵糖量、优化存在的酵母的浓度，保温罐的流体动力学(通过改进酵母菌与啤酒的接触改善双乙酰的去除)和采取进一步的措施消除此阶段的氧而进一步获得改进。
附录3中给出了计算的啤酒容积生产率。此节用生物反应罐连续操作，滞留时间24小时，然后48小时分批保温，显示生产率是目前产业化分批工艺的1.8倍。较快的产业化分批工艺一个循环7.5天，啤酒容积生产率为0.093立方米/(立方米罐容量乘天数)，而本文所述连续工艺啤酒生产率为0.165立方米。如果进一步研究可将分批保温期缩短至24小时，啤酒生产率将比产业化分批方法高2.3倍。如果24小时连续工艺不用分批保温，啤酒容积生产率将是分批方法的7.5倍。除了提高容积生产率外，其它从分批改成连续工艺的优点是，如缩短上市前的时间、减少酿酒房体积和较少需要酵母菌增殖，这些必须与相对操作成本的仔细分析相平衡。
其他学者(Kronlof and Virkajarvi，1996；Nakanishi等，1993；Yamauchi等，1995)致力于开发多阶段连续发酵，其中第一阶段连续发酵(需氧)只导致麦芽汁可发酵糖部分消耗。虽然此法在香味物产生上显示了某些成功，但此系统很复杂。另外，此系统第一个需氧阶段产生了更易受微生物污染的环境(高的糖浓度、温度和氧，以及低的乙醇浓度)。本工作在气升式生物反应罐系统进行，反应罐可发酵糖浓度低、pH低、乙醇浓度高、氧浓度低，使其环境不适宜发生潜在的污染。

曲线图7.22气升生物反应罐连续初发酵后48小时需氧和厌氧保温后获得的归一化浓度的放射图。归一化数据依据一式二份样品的平均值，商品啤酒的数据取自附录6中列出数据的中点。
7.2.3啤酒连续初发酵期间液体滞留时间对酵母菌重要代谢物的影响。
曲线图7.23-7.28显示从生物反应罐液相获得的分析结果。表7.3列出了此实验所用二种液体滞留时间测定的拟稳态(至少经3次反应罐周转)时分析物的平均浓度和流速。虽然麦芽汁输入反应罐的流速增加时液相中酵母菌存活力无明显变化，但酵母菌浓度改变了，见曲线图7.23。
表7.3(a)小结了生物反应罐滞留时间对处于拟稳态的液相酵母菌和酵母菌重要代谢物浓度(平均值)的影响；(b)小结了生物反应罐滞留时间对反应罐出口处于拟稳态的液相酵母菌和酵母菌重要代谢物流速(平均值)的影响。
图7.23液相中酵母菌浓度与相对连续发酵时间的关系，反应罐中液体滞留时间的影响。Rt是反应罐中液体滞留天数。
图7.24和7.25显示当液体滞留时间从1.8天减少至0.9天时麦芽汁底物游离氨基氮(FAN)和总可发酵糖(作为葡萄糖)浓度均增加。从表7.4的物质平衡可见伴随着反应罐滞留时间减少，总可发酵糖(作为葡萄糖)的消耗速度增加而游离氨基氮消耗速度降低伴随液体滞留时间减少。从可发酵糖发酵产生乙醇的产率因子YP/S，从0.3增加到0.5。因为用空气和二氧化碳气喷气入该系统，气相中乙醇可能有较小损失，这可能通过影响乙醇平衡而影响产率因子YP/S。BudacandMargaritis(1999)合作进行的研究已采用气相色谱-质谱技术(GC-MS)定量地证明，在连续发酵时气升生物反应罐顶板检测到啤酒香味挥发物包括乙醇、乙醛、乙酰酸酯和乙酸异戊酯。
曲线图7.24液相中乙醇和可发酵葡萄糖浓度对相对连续发酵时间的关系，反应罐中液体滞留时间的作用。Rt是反应罐中液体滞留天数。
曲线图7.25液相中游离氨基氮和1-丙醇浓度与相对连续发酵时间的关系，反应罐中液体滞留时间的作用。Rt是反应罐中液体滞留天数。
表7.4 根据表7.3的平均数据，对游离氨基氮和总可发酵糖类(作为葡萄糖)的物质平衡，滞留时间的作用。
取自附录1的入口浓度液相中发酵产物乙醇的浓度随液体滞留时间变化而降低。然而作为整体此系统在较短液体滞留时间根据质量流量可产生更多乙醇。因为本工作目的不只是单独生产乙醇，而是生产许多成分平衡的啤酒，最高的乙醇生产率必须与其它因素相平衡。商品化啤酒初发酵结束时绝大多数可发酵葡萄糖底物必须耗尽。
曲线图7.26显示乙醛和总双乙酰浓度对麦芽汁流速变化的反应。当液体滞留时间减少时分析物浓度及其产率增加。在啤酒分批发酵时发酵的最初几天酵母菌排出乙醛(kunze，1996)。
曲线图7.26液相中总双乙酰和乙醛浓度与相对连续发酵时间的关系，生物反应罐中液体滞留时间的作用。Rt是反应罐液体滞留天数。
曲线图7.25和7.27显示减少反应罐滞留时间对液相中高级醇1-丙醇、异丁醇和异戊醇浓度的影响。当反应罐滞留时间减少时，这三种高级醇浓度降低。
曲线图7.27液相中异丁醇和异戊醇浓度与相对连续发酵时间的关系，生物反应罐中液体滞留时间的影响。Rt是反应罐液体滞留天数。
表7.3(b)给出乙酸乙酯和乙酸异戊酯的质量流量，二者在液体滞留时间降低时均增加。曲线图7.28显示液相中乙酸乙酯浓度降低而乙酸异戊酯上升。因为此实验让液相中细胞增殖增加但不增加对该系统的氧供应，此时反应罐中的条件促进了酯产生。Hough等(1982)说提高增殖和降低氧这种条件有利于酯产生。
图7.28液相中乙酸乙酯和乙酸异戊酯浓度与相对连续发酵时间的关系，生物反应罐中液体滞留时间的作用。Rt是反应罐液体滞留天数。
7.2.4采用α-乙酰乳酸脱羧酶商品还原啤酒连续初发酵期间的总双乙酰。
实验1在完成此试验前生物反应罐污染了需氧生长的革兰阳性球菌。因为提供的麦芽汁微生物测定显示无污染，故确定为反应罐本身被污染。这提出反应罐需升级以提高抗污染的安全等级。然而，关闭该系统前当将ALDC加入供应的麦芽汁中时发现总双乙酰浓度下降。不幸的是从此数据不能得出任何结论，因为反应罐污染有混淆作用。
实验2由于许多生物反应罐升级，整个实验2期间操作此系统没有污染。曲线图7.29-7.31给出了此实验的数据。表7.5小结了加入ALDC前后总双乙酰的拟稳态平均浓度。麦芽汁中加入ALDC，总双乙酰浓度下降47％，这使此酶将来具有应用前景(平均值取自三次反应罐周转)。如曲线图7.30和7.31所示此试验期间总可发酵糖(作为葡萄糖)和细胞浓度略有变化，这可能因为加入ALDC前后供给反应罐的麦芽汁有轻微不同而引起。
曲线图7.29液相中总双乙酰浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验2。
曲线图7.30液相中可发酵糖(作为葡萄糖)和乙醇浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验2。
曲线图7.31液相中细胞浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验2。
为了消除麦芽汁变化的潜在混淆作用，实验3中从酿酒房收集大量麦芽汁(1400升)，当达到拟稳态基线时将ALDC直接加入保温罐中的麦芽汁中。这进一步消除麦芽汁潜在的不均一可能影响到实验2的进行。此麦芽汁贮罐装有二氧化碳气喷嘴可使供给的麦芽汁溶氧水平恒定地保持低水平。
实验3曲线图7.32-7.34说明啤酒连续发酵期间供给的麦芽汁中加入ALDC对总双乙酰、总可发酵糖(作为葡萄糖)、乙醇和游离悬浮细胞浓度的影响。表7.6也给出了麦芽汁中加入ALDC前后拟稳态总双乙酰平均浓度(平均值取自三次反应罐周转后)。此实验期间任何时间均没测出污染。加入ALDC时总双乙酰浓度下降45％。未见乙醇、总可发酵糖(作为葡萄糖)或游离悬浮细胞浓度有明显差异。这与AschengreenandJepsen(1992)的分批发酵所见相一致。
曲线图7.32液相中总双乙酰浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验3。
曲线图7.33液相中乙醇和总可发酵糖(作为葡萄糖)浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验3。
曲线图7.34液相中细胞浓度与连续发酵时间，麦芽汁发酵培养基中加入ALDC的影响。实验3。
实验2和3的结果表明气升生物反应罐连续发酵时ALDC的确对总双乙酰浓度有显著影响，总双乙酰平均下降46％。这具有减少或消除使连续气升系统中的双乙酰减少的次级加工的潜力。这些初步试验采用了较高剂量的ALDC，因此如此工艺采纳此酶需要优化给予麦芽汁的ALDC的数量、方法和时间。如果在酿造发酵条件下可利用的此酶具有高活性，或可将此酶固定化而得以重复使用可进一步节省成本(Dulieu等，1996)。另一种考虑是公众可接受的经遗传修饰的微生物生产的酶添加剂。供货商推荐的剂量为2kg/100000L，加入商品酶的成本$131.05/kg，发酵材料成本增加$0.26/hL。如进行这些实验所使用的，此酶剂量为72μg/L(108ADU/L)或7.2kg/1000hLALDC，增加材料费用$0.94/hL。气升连续发酵期间采用ALDC降低双乙酰的经济学取决于生物反应罐条件下酶的最佳剂量和其使用所节约的时间。
表7.5麦芽汁发酵培养基中加入ALDC对气升反应罐中啤酒连续发酵总双乙酰浓度的平均拟稳态作用
*根据三次反应罐周转时间后拟稳态值平均。
根据以下标准，上文支持在气升通流管式生物反应罐系统中采用固定化酵母菌和相关游离细胞连续发酵的提议是替代分批发酵生产啤酒的一种切实可行的方法—达到口味相配，—生物反应罐容积生产率较高，—复杂性极小，—显示能长期连续操作，—通过控制流化气体中的空气(氧)控制香味，—加入α-乙酰乳酸脱羧酶作为控制双乙酰的一种选择，—无细菌污染，—财政上获益。
仍有许多领域需要进一步研究，但该技术不难在更大规模测试。气升生物反应罐已用于产业规模的废水处理，这使得扩大啤酒连续发酵的规模技术上可行。荷兰的Grolsch酿酒房已报导采用230立方米气升反应罐来处理其废水(Driessen等，1997)。酿造产业商品规模连续发酵的最大障碍之一可能是被产业传统深深束缚的酿酒师是否能接受一种新工艺。此工作实行的啤酒连续发酵期间产生的酵母菌次级代谢物数据的收集强调了为产生啤酒香味控制流化气体中的氧的重要性。此发现表明在给定的操作条件下提高反应罐流化气体中的空气导致乙醛、双乙酰和高级醇(异戊醇和异丁醇)的升高，同时酯(乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯)和乙醇浓度下降。这些数据提示有可能通过控制反应罐流化气体的组成控制啤酒口味，得以生产出独特的产品。
例外是当去除流化气体中的空气时反应罐液相中游离悬浮细胞浓度维持大于108细胞/ml。此系统在反应罐中有一个以上的酵母细胞群固定化酵母菌和液相悬浮酵母菌。因为大量活的酵母菌在反应罐的液相中增殖，有可能利用连续生物反应罐作为酵母菌增殖器。连续初发酵后增加48小时的分批。保温期可获得在市售啤酒范围内的口味。实验证明为产生此口味该保温期温度为1℃，重要的是最大程度减少保温期液体接触氧。然而，除了保温期使该工艺增加了二天以及其它复杂性外，此法比要花7-14天的商业分批发酵仍明显要快。
最后，理想的情况是通过优化连续初级生物反应罐中的条件完全消除次级保温期。然而通过优化保温期温度(酵母菌清除双乙酰非常依赖温度)、保温期开始时存留在液体中的可发酵糖量、存在的酵母的浓度、保温罐的流体动力学特征(通过改进酵母菌与啤酒之间的接触可促进除去双乙酰)和采取消除此期中的氧的措施可进一步缩短次级保温时间。
其他学者(KronlofandVirkajarvi，1996；Nakanishi，1993；Yamauchi等1995)致力于开发多阶段连续发酵，其中连续发酵第一阶段(需氧)导致只部分消耗掉麦芽汁中的可发酵糖类。虽然此策略就口味产生而言显示了某些成功，但这些系统很复杂。另外，此系统的第一个需氧阶段产生了对微生物污染更易感的环境(如高的糖浓度、温度和氧，及低的乙醇浓度)。本工作的气升生物反应罐具有低的稳态可发酵糖浓度、低pH、高乙醇浓度和低氧浓度，这使环境不适宜潜在的污染。在久开发的酿酒房，尽量减少复杂性和开发机器人抗污染工艺是成功的重要因素。向供连续发酵的麦芽汁中加入α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)商业制剂显示平均可降低双乙酰46％。然而因为ALDC是遗传修饰的微生物(GMO)产生的一种酶，在将此酶用于商品前这是需要向公众说明的事情。此外，控制双乙酰的商品化酶在发酵条件下不具有最佳活性。
用κ-角叉菜聚糖凝胶固定连续发酵6个月以上，液相中游离悬浮细胞保持90％以上的存活力，而固定化细胞的存活力降至不到60％。扫描电镜揭示位于凝胶珠外周的细胞具有多处芽痕和规则的形态，而珠中心附近的细胞形态不规则，芽痕很少，提示生长受损。显微镜也提示位于珠中心附近的酵母菌呈现衰老迹象。如第5节所讨论κ-角叉菜聚糖凝胶有许多特征使其成为理想的酵母菌固定化基质。然而目前还没有制造珠的产业化方法，因为要将酵母菌包埋在基质中作为珠制造工艺的一部分商业工厂中珠的处理增加了复杂性和成本。其它固定化方法如自聚集或絮凝应进一步探索。这可能消除在工厂环境中处理珠的复杂性，并且如能有规律性破坏酵母菌絮凝物，就可保证从生物反应罐中有规律地去除衰老细胞。
权利要求
1.一种生产可饮用酒精的工艺，该工艺在初步发酵含可发酵糖类的麦芽汁时采用连续发酵阶段，然后将该连续加工排出的“至少部分发酵的产物”输送至分批加工阶段以完成发酵。
2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述可饮用酒精是一种啤酒。
3.如权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述啤酒是一种淡色型啤酒。
4.如权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述啤酒是一种贮陈啤酒。
5.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述啤酒是北美型啤酒。
6.一种连续发酵生产啤酒的工艺，该工艺采用絮凝酵母菌株并限制氧的供应在气升式生物反应罐中至少部分发酵麦芽汁。
7.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述发酵是初发酵。
8.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，连续发酵阶段在气升式生物反应罐中进行。
9.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述连续发酵阶段采用固定于载体的酵母菌或絮凝酵母菌之一的“固定化”细胞。
10.如权利要求9所述的工艺，其特征在于，选用絮凝酵母菌。
11.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，在所述分批保温阶段完成所述初发酵。
12.如权利要求11所述的工艺，其特征在于，所述工艺降低了双乙酰浓度。
13.如权利要求11所述的工艺，其特征在于，所述工艺降低了乙醛浓度。
14.如权利要求11所述的工艺，其特征在于，高级杂醇的浓度基本上维持不受分批保温加工阶段的影响。
15.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，将连续发酵阶段排出物通过一多岐管道输送至多个分批保温罐之一，在其特征在于，进行分批保温加工。
16.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述连续加工是加料后在分批保温阶段进行分批发酵加工。
全文摘要
采用连续发酵阶段加入和/或初步发酵含可发酵的糖类的麦芽汁，来生产可饮用酒精。一个示范性的连续发酵阶段包括利用超絮凝酵母菌和严格的氧控制，并采用气升式生物反应罐。此连续阶段之后可将该连续加工的至少部分发酵的排出物输送至分批加工阶段以完成发酵。
文档编号C12CGK1694950SQ02816264
公开日2005年11月9日 申请日期2002年6月20日 优先权日2001年6月20日
发明者P·H·皮尔金顿, N·A·蒙索 申请人:勒柏特酿造有限公司